【摘 要】
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目的蛇毒Cystatin基因的合成并在大肠杆菌中表达。方法 根据中华眼镜蛇毒Cystatin蛋白的氨基酸序列合成Cystatin基因的四个片段,通过缓慢退火PCR的方法将其拼接为完整的Cysta
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目的蛇毒Cystatin基因的合成并在大肠杆菌中表达。方法 根据中华眼镜蛇毒Cystatin蛋白的氨基酸序列合成Cystatin基因的四个片段,通过缓慢退火PCR的方法将其拼接为完整的Cystatin基因。经BamH I及Sac I双酶切后定向克隆到原核表达载体pET-42a(+)中,PCR及测序鉴定,转化宿主菌BL21(DE3)。IPTG诱导GST-Cystatin融合蛋白表达,SDS-PAGE凝胶电泳鉴定表达产物。GST·Mag琼脂糖树脂纯化融合蛋白,Western-blot鉴定。GST-Cystatin融合蛋白经Xa因子酶切去除融合标签GST·Tag,Western-blot鉴定重组的Cystatin蛋白。结果 成功合成蛇毒Cystatin基因,并构建原核表达质粒pET-42a(+)-Cystatin,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达融合蛋白GST-Cystatin,SDS-PAGE凝胶扫描分析显示表达量占菌体总蛋白的30%,Western-blot证实纯化蛋白为GST-Cystatin融合蛋白。GST-Cystatin融合蛋白经Xa因子酶切后获得纯化重组蛇毒 Cystatin蛋白,初步测定其具有木瓜蛋白酶抑制活性。结论 成功合成蛇毒Cystatin基因并在大肠杆菌中表达,获得纯化重组蛇毒 Cystatin蛋白,为进一步研究其生物学活性及抗肿瘤转移功能奠定了坚实的基础。
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