论文部分内容阅读
目的:组蛋白去乙酰化酶是癌症治疗研究的重要靶点之一。本论文运用药物化学和有机化学的方法,设计合成了两种骨架结构的异羟肟酸类化合物。第一个课题中含有哌啶三氮唑异羟肟酸的骨架结构,使其靶向于组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）;第二个课题中以HDAC结构片段为支架,连接着热休克蛋白（Hsp90）抑制剂的关键结构片段。第二个课题中骨架结构同时对HDAC和Hsp90两个靶点有抑制作用。这种双靶点抑制剂化在预防治疗耐药性和增强协同效应方面可能比单作用药物具有更大的治疗效益。方法:通过药物化学设计的手段,哌啶三氮唑作为WY系列结构母核的异羟肟酸化合物,引入20个芳香酰氯取代基合成20个目标化合物。以文献报道的Hsp90抑制剂VER49009作为HDAC抑制剂的CAP部分,以脂肪链连接异羟肟酸的结构。通过改变脂肪链的长度来合成另一系列的目标化合物。文献认为4到8个碳链的长度对HDAC的抑制活性最好。运用有机化学的手段和方法,通过Boc保护、Click反应、脱Boc保护,酰胺缩合、肟化反应等过程,合成出所设计的WY和WBL系列化合物。运用薄层色谱、三氯化铁显色以及HPLC色谱进行初步鉴定WY系列和WBL系列化合物的纯度。运用质谱、核磁共振氢谱、核磁共振碳谱对两个骨架化合物结构和纯度进行确证。运用体外筛选U937细胞抗HDAC6活性及生长抑制作用,并筛选了WY系列20最终产物对HDAC6的双重浓度（1和10μM）抑制活性。运用MTT法,检测化合物WY-12和WY-15对HL-60、U937、NCI-H929、U266、Sy5y、MCF-7细胞的抗增殖活性。运用HDAC荧光检测试剂盒,检测WY-15对HDAC1,2,3,6,8的亚型择性。运用western blot检测8种浓度的WY-15处理HL-60细胞乙酰组蛋白H3（Ac-HH3）表达水平的变化,验证WY-15的抗HDAC活性。运用体外细胞周期检测试验,评估了WY-15对Sy5y细胞的细胞周期阻滞作用。运用LeDock分子对接软件,采用Danio rerio HDAC6催化域HPB络合的晶体结构（PDB代码:5WGK）对WY-15化合物进行分子模拟。用人乳腺癌MCF-7和食管癌Eca-109细胞筛选WBL系列5个化合物的活性,来观察其抗增殖效果。结果:本课题分别作了小分子HDAC抑制剂和双HDAC-Hsp90靶点抑制剂,都通过质谱、核磁共振氢谱、核磁共振碳谱结构确证。20个化合物在两种浓度下对HDAC6均表现出中等的抑制活性,其中有5种化合物（WY-3,WY-7,WY-10,WY-12,WY-15）对HDAC6显示较好的抑制活性,这些化合物在1μM浓度下抑制率高于50%,在10μM浓度下超过90%。这表明,他们是HDAC6有效的抑制剂。只有两种化合物,WY-12和WY-15表现出良好的抗增殖活性,并且具有合适的cLogP值,有助有顺利穿透细胞膜。化合物WY-12和WY-15对6个肿瘤细胞系均表现出中等的抗增殖活性,GI50值在微摩尔范围内。WY-15的活性优于WY-12。对NCI-H929、Sy5y细胞,WY-15显示强大的增殖抑制活性,化合物的GI50值1.20μM和1.88μM,阳性对照SAHA分别是0.85μM和1.11μM。WY-15对HDAC6和HDAC8表现出较弱的选择性。类似于对照化合物SAHA,WY-15以剂量依赖的方式从6μM to 100μM引起Ac-HH3的显著表达,结果表明,WY-15是一种具有细胞活性HDAC抑制剂。在WY-15处理后,Sy5y细胞在G0/G1期明显被抑制,且呈浓度依赖性。很明显观察到的百分比Sy5y细胞G0/G1期（0μM）从57.3%上升80.04%（10μM）。化合物15对HDAC6的分子模拟结果显示,WY-15“CAP”的2-萘乙酰基与HDAC6疏水入口吻合良好,Linker是4-哌啶三氮唑部分可以插入口袋内,WY-15的异羟肟酸基团与HDAC6的Zn2+以单齿的方式顺利螯合。WBL系列5个化合物对人乳腺癌MCF-7和食管癌Eca-109细胞抗增殖活性,显示出了良好的抗增殖效果,其GI50值在微摩尔范围,且呈碳链数越少活性越强的趋势。接下来将进行WBL系列药理活性的进一步测试。结论:本论文设计合成了20种以4-哌啶三氮唑为母核的羟基肟酸类WY化合物和5种含有Hsp90抑制剂关键药效团的羟基肟酸类WBL系列化合物,分别作为新型HDAC 6选择性抑制剂和Hsp90-HDAC双靶点的抑制剂。所述化合物WY-12和WY-15均表现出良好的抗肿瘤活性。