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研究背景：乳腺癌是女性常见恶性肿瘤之一。全世界每年约有120万妇女患乳腺癌。在欧美发达国家,乳腺癌的发病率占妇女恶性肿瘤之首。在我国,随着生活水平的提高发病率呈逐年递增趋势,严重危胁着广大女性健康。最近研究发现,真核翻译起始因子(eukaryotic translation initiation factors, elFs) eIF4E在恶性肿瘤的发生发展和演进过程中发挥着重要作用。在真核细胞中,eIF4E与eIF4A、eIF4G共同装配成eIF4F复合物,启动具有5’帽式结构的mRNA翻译过程。eIF4F复合物的装配受到eIF4E结合蛋白(eIF4E binding proteins,4E-BPs)家族成员的控制。低磷酸化水平4E-BPs能够通过封闭eIF4E阻断eIF4F复合物的装配,而高磷酸化水平的4E-BPs则丧失封闭eIF4E的功能。4E-BPs的磷酸化主要受到PTEN/PI3K/Akt/mTOR信号转导通路调控,并依赖于mTOR对其氨基末端RAIP基序和羧基末端TOS基序的识别,其中RAIP基序同时参与4E-BP1氨基末端位点和羧基未端位点的磷酸化,而TOS基序主要影响S65和T70以及非雷帕霉素敏感位点S101的磷酸化。因此,我们推测删除4E-BPs的RAIP基序和TOS基序能够避免外源性4E-BPs被磷酸化,从而高效阻断eIF4F复合物的装配,进而抑制肿瘤生长并诱发肿瘤消退。实验目的：删除4E-BP1和4E-BP3cDNA中的RAIP基序和TOS基序编码序列,构建真核表达载体。在此基础上,使用细胞学实验手段探索截短型4E-BP1和4E-BP3对小鼠乳腺癌4T1细胞增殖、凋亡和迁移到影响,进而使用小鼠乳腺癌模型评价截短型4E-BP1和4E-BP3基因治疗的效果,并初步探讨截短型4E-BP1和4E-BP3基因治疗诱导肿瘤消退的分子机制。实验方法及实验结果：1)用RT-PCR和分子克隆技术分别构建截短型4E-BP1和4E-BP3真核表达载体,通过双酶切及测序鉴定了其正确性。2)应用MTT法、WST-1法检测截短型4E-BP1和4E-BP3对细胞增殖能力的影响,结果显示截短型4E-BP1和4E-BP3均具有抑制4T1细胞增殖的作用。用伤口愈合(wound-healing)实验和Transwell小室法检测转染截短型4E-BP1和4E-BP3对细胞迁移能力的影响,结果显示截短型4E-BP1和4E-BP3均能抑制细胞迁移。使用流式细胞术测定截短型4E-BP1和4E-BP3转染对细胞凋亡的影响,结果显示截短型4E-BP1和4E-BP3均能促进4T1细胞凋亡。3)建立小鼠乳腺癌动物模型,使用InvivojetPEI介导在体内转染pSecX-4EBP1和pSecX-4EBP3评价截短型4E-BP1和4E-BP3基因治疗的效果。结果表明,每周一次,共3次基因治疗后,与治疗前相比,截短型4E-BP1治疗组和截短型4E-BP3基因治疗组肿瘤体积分别消退64.5%和50.0%。肿瘤组织切片进行HE染色检测肿瘤组织病理变化,并用免疫组化法检测MDM-2、HIF-1α在肿瘤组织中的表达,结果显示截短型4E-BP1和4E-BP3均可使肿瘤组织出现大而积坏死,并能够下调MDM-2、 HIF-la表达。4)根据SDS能够升高TritonX-114的雾点,而NaCl能够降低TritonX-114的雾点,建立了等温TritonX-114内毒素去除法,并证实经三个循环的TritonX-114处理后,质粒样品中的内毒素含量低于0.1EU/μg,达到无内毒素水平。