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人线粒体DNA（mtDNA）是存在于线粒体内的双链环状DNA分子，长16，569bp，基因编码产物包括2种rRNA、22种tRNA及13种多肽链。其中多肽链是氧化磷酸化酶复合体的重要组成成分，而rRNA和tRNA则参与这些多肽链的合成。因此，mtDNA上任何基因的突变，都可能影响氧化磷酸化的功能。1988年，人类首次发现mtDNA点突变与临床疾病有关，截止目前，在mtDNA上发现的病理性突变已达50种以上，其中大部分为点突变。近年来，随着遗传科学的发展，又发现mtDNA点突变与人类衰老与某些癌症的发生有关。因而，研究mtDNA突变的产生以及突变的致病机制，对维护人类健康具有重要意义。 mtDNA突变的种类很多，由此产生的疾病症状也复杂多样。这些特点在线粒体 tRNALeu（UUR）基因（MTTL1）部位表现得十分明显。目前己发现的MTTL1基因的点突变种类有21种，突变与疾病之间的对应关系复杂，既可能一种突变产生多种疾病，也有可能多种突变产生相同的疾病症状。如3243，3252，3271，和3291位点的突变均可导致线粒体脑肌病伴乳酸酸中毒及中风样发作综合症（MELAS），其中3243位点突变又可导致母系遗传性糖尿病或耳聋；3303与3260位点突变是心肌病和肌无力的发病原因，但两者发病时间不同。因而，人线粒体MTTL1基因是研究mtDNA突变与相关疾病的理想靶基因。 本实验主要探索人线粒体tRNALeu（UUR）基因（MTTL1）点突变发生的原因以及MTTL1基因内A3243G点突变的致病机理。 一．人线粒体tRNALeu（UUR）基因氧化损伤与修复研究 人mtDNA比核DNA更易受到自由基的氧化损伤，这些损伤可以被线粒体内的DNA修复机制所修复，损伤与修复是决定突变是否产生的两个重要因素，为了确定氧化损伤与损伤后修复对mtDNA突变的具体影响，本实验我们采用四氧嘧啶处理LO2细胞，这种试剂进入细胞后，经氧化还原反应，生成的自由基与线粒体自身代谢产生的自由基类似，然后观察自由基对细胞mtDNA的氧化损伤与损伤后DNA修复的动力学变化。由于线粒体的正常功能为修复机制所必需，实验采用MTT细胞活力实验检测不同浓度四氧嘧啶处理下线粒体酶活力，发现9mM四氧嘧啶培养细胞1h后，线粒体琥珀酸脱氢酶功能在撤去药物后0，2，8和第二军医史学博士论文 人线粒体tRNAt。…uu R。基因点突变的研究24h时问点均无明显变化。实验提取各组细胞的mtDNA，用EndolII和Fgp两种酶切除受氧化损伤的核苷酸，然后用碱性琼脂糖凝胶电泳分离大小不等的mtDNA，Southern杂交，地高辛一抗体．碱性磷酸酶系统显色，检测完整与断裂的mtDNA量，利用Poisson公式（s=．1nP0／P，P0为未断裂链光密度值，P所有链光密度值总和）计算一个mtDNA分子的平均损伤频率，结果显示，9mmol／I，四氧嘧啶处理细胞1h，链平均损伤频率由对照的0．11个／分子增加至5．60个／分子，明显增加了m‘tDNA上核苷酸的氧化损伤，除去药物后8h，绝大部分损伤可被修复，损伤频率减至0．40个／分子，除去药物后24h核苷酸的氧化损伤恢复至正常水平。实验采用接头介导：PCR．（【,M-PCR．）检测MTTL，基因区域内单个核苷酸的损伤与修复动力学。这种方法可以检测各组mtDNA上MTTL，基因75bp区域内单个核苷酸损伤的部位及频率。结果显示，人MirTL』基因存在20个易受氧化损伤的核苷酸热点，经与相应区域内文献报道的16个突变热点比较，有12个热点部位重合，而修复未显示热点部位或区域。结果提示，自由基对核苷酸的选择性氧化损伤是决定mtDNA点突变发生及发生部位的主要原因。二．人线粒体tRNALeu‘uuR’基因（MTlZJ）A3243G点突变致病机理研究 在tRNA基因点突变中，人线粒体tRNAm(uuR’基因（MTTL|『）A3243G点突变为最常见类型，携带突变的病人可表现为神经性耳聋、线粒体脑肌病伴乳酸性酸中毒及中风样发作综合征（ME[。AS病）等多种症状。目前已有研究表明，在ME[。AS病人中，线粒体内tRNAm(uuR’的表达量并没有下降，提示该突变可能影响tRNAk“(uUR’的生物学活性。由于在蛋白质生物合成过程中，tRNA具有多种生物学功能，任一环节功能的缺陷或丧失均影响基因信息的准确和适量表达，这无疑给疾病机制的探讨带来很大的困难。 本部分利用大肠杆菌BL21．CodonPlus（DE3）一RII。表达人线粒体亮氨酰tRNA合成酶（mtI。euRS），同时人工合成人线粒体野生型与突变型MTTL J『基因，利用大肠杆菌JMl09表达野生型与．A324．3G突变型tRNAⅢ‘uu阶，采用人线粒体亮氨酰tRNA合成酶（mt[,euRS）催化两种tRNALeu(uuR’与亮氨酸的特异性结合反应，观察A3243G点突变对tI州ALeu【uuR’亮氨酰化活性的影响，为相关疾病机制的探讨乃至疾病的治疗提供理论基础。（一）人线粒体亮氨酰．tRNA合成酶（【,euRS）的表达及酶促动力学研究弟二军医土学博士论文 人线粒体tRNAt“‘。讯基因点突变的研究 人线粒体亮氨酰．tRNA合成酶（mtl．euRS）由核基因编码，其cDNA基因全长2712bp,编码产物分子量约为101kD，甘j 903个氨基酸组成，其中N端的21个氨基酸为线粒体特异性信号肽，成熟mtI．euR．S籍此信号肽进入线粒体，参与线粒