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目的：①构建携带IL-2/NK4双基因的减毒沙门氏菌DNA疫苗TPIN，进行稳定性检测及体外表达鉴定；②研究重组菌株TPIN对人肝细胞癌HepG2细胞致癌作用的影响；③建立荷瘤小鼠动物模型，以重组菌TPIN口服免疫荷瘤小鼠，观察其对肿瘤组织生长的抑制作用。方法：1利用基因工程技术构建同时携带IL-2及NK4基因的双基因真核共表达载体，构建成功后进行体外表达检测；2采用电转化方法将真核共表达质粒PCMV-IL-2-IRES-NK4电转化入减毒沙门氏菌菌株Ty21a中，构建得到重组减毒沙门氏菌DNA疫苗菌株TPIN，将其在含氨苄青霉素和不含岸边青霉素的LB培养板上传代培养40代，每隔10代抽提质粒并进行酶切鉴定进行疫苗菌的稳定性检测；将其转化体外细胞，ELISA及RT-PCR检测TPIN在体外表达IL-2/NK4基因及蛋白水平；3TPIN体外转化人肝癌细胞株HepG2， MTT法检测表达产物IL-2/NK4对HepG2细胞增殖的影响，Transwells法检测IL-2/NK4表达产物对肿瘤细胞迁移的影响，测定IL-2/NK4表达产物对鸡胚绒膜尿囊膜血管生成的影响；4建立荷瘤小鼠动物模型，口服免疫TPIN后观察荷瘤小鼠瘤体体积及重量的变化，观察其抗肿瘤效果。结果：1成功构建了真核共表达载体pCMV-IL-2-IRES-NK4，以脂质体转染细胞后，ELISA及RT-PCR法检测结果表明其可在体外细胞中同时并稳定高效表达IL-2及NK4基因和蛋白；2成功构建了携带IL-2/NK4双基因真核共表达的减毒沙门氏菌DNA疫苗菌株TPIN，其在含氨苄青霉素和不含氨苄青霉素LB培养板上分别传代培养40代，质粒均不丢失，将其转化体外细胞，ELISA及RT-PCR结果表明其可在体外稳定高效表达IL-2、NK4基因及蛋白；3重组菌株TPIN可在体外有效转化肿瘤细胞并表达目的蛋白IL-2及NK4，表达产物IL-2/NK4对肿瘤细胞的增殖有一定的抑制作用，并可抑制HGF介导的肿瘤细胞迁移，对靶细胞有一定的生物活性作用。4TPIN口服免疫荷黑色素瘤小鼠后，测定治疗组未治疗组肿瘤生长曲线，发现TPIN治疗组小鼠黑色素瘤生长被显著抑制，表明我们制备的抗肿瘤基因药物TPIN具有一定的抗肿瘤效果。结论：本实验研究中，我们成功构建了携带IL-2/NK4双基因的减毒沙门氏菌DNA疫苗，其可稳定传代，具有较高的稳定性，并能在体外有效传递表达目的基因及蛋白，且具有一定的抗肿瘤效应，将其口服免疫荷瘤小鼠后，其可在宿主体内高效稳定表达目的基因及蛋白，对实体瘤的生长有显著的抑制作用。