【摘 要】
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目的:通过对库蠓种类进行鉴别,并对其腹部血粉进行PCR鉴定,判断库蠓胃血来源,分析不同种类库蠓吸血偏好,了解其吸血习性,确定库蠓可能的取食范围及病原体传播的物种类群,为库蠓防治工作提供参考依据。利用库蠓提取物,构建库蠓-小鼠过敏模型,研究库蠓提取物致敏小鼠免疫反应模式,为进一步深入研究库蠓叮咬过敏及其他过敏疾病机制提供模型工具,同时为吸血昆虫叮咬过敏治疗药物的筛选及开发提供基础。方法:1.利用灯诱
【基金项目】
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国家自然科学基金（No.31960102）
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目的:通过对库蠓种类进行鉴别,并对其腹部血粉进行PCR鉴定,判断库蠓胃血来源,分析不同种类库蠓吸血偏好,了解其吸血习性,确定库蠓可能的取食范围及病原体传播的物种类群,为库蠓防治工作提供参考依据。利用库蠓提取物,构建库蠓-小鼠过敏模型,研究库蠓提取物致敏小鼠免疫反应模式,为进一步深入研究库蠓叮咬过敏及其他过敏疾病机制提供模型工具,同时为吸血昆虫叮咬过敏治疗药物的筛选及开发提供基础。方法:1.利用灯诱法采集重庆綦江地区不同生境库蠓,对库蠓进行形态学分类鉴定,通过分子鉴定及发育树构建对形态学鉴定结果进行复核,分析不同生境库蠓分布。2.利用物种COⅠ基因序列,设计物种特异性引物,提取库蠓腹部血粉DNA,利用特异性引物进行PCR,根据扩增结果,判定宿主物种。3.利用库蠓提取物两步法致敏6周小鼠:在第0、7、14、21天用库蠓提取物加明矾佐剂对小鼠进行腹腔注射（IP）致敏,在第28、31和35天进行库蠓提取物皮内注射（ID）致敏,对照组则在相同条件下用PBS注射。4.对致敏后小鼠进行行为学观察,及库蠓提取物致敏部位进行形态学检测;利用ELISA每14天测定特异性抗体Ig E及Ig G亚类的表达情况;在致敏42天后,提取小鼠脾细胞,利用MTT法测定库蠓提取物对小鼠脾细胞增殖的影响,同时通过q PCR检测库蠓提取物处理后小鼠脾细胞细胞因子表达情况。结果:1.重庆地区4种不同圈舍（猪舍、羊舍、鸡舍及鸡鸭混合舍）采集到7种主要库蠓类群,扩增获得7种库蠓COⅠ基因,经测序及序列比对,库蠓种类匹配成功,以COⅠ基因序列对7种库蠓构建NJ分子树和ML分子树。分子鉴定结果均与形态学鉴定结果一致,各种类库蠓分别形成一个单支,无种类交叉情况。2.不同畜舍所分布的库蠓种群有所不同,羊舍、鸡舍和鸡鸭混合舍的优势种均为荒川库蠓C.arakawai,分别占捕获总数的75.26%、93.36%和94.96%;而猪舍的优势种则为洋岛库蠓C.kinabaluensis,占捕获总数70.77%。通过随机抽样,对6种主要库蠓的190份饱血库蠓胃血进行PCR检测,结果显示6种库蠓类群都存在兼性吸血的现象,可以4～6种动物的血液为食,其中荒川库蠓C.arakawai、洋岛库蠓C.kinabaluensis、琉球库蠓C.actoni和陵水库蠓C.lingshuiensis均吸食鸡血,洋岛库蠓C.kinabaluensis还喜食羊血和猪血,尖喙库蠓C.oxystoma和刺螫库蠓C.punctatus则偏好吸食猪血和羊血,此外琉球库蠓C.actoni和荒川库蠓C.arakawai兼吸食人血,两者吸食人血比例分别为56.52%和1.39%。3.制备库蠓提取物,通过腹腔注射（IP）及皮内注射（ID）库蠓提取物两步法构建库蠓-小鼠过敏模型,致敏组小鼠在库蠓提取物致敏后,对致敏部位抓挠行为较对照组明显（P＜0.001）,且致敏部位皮肤出现组织水肿及淋巴细胞浸润情况。此外,致敏组小鼠血清中Ig E（P＜0.05）及Ig G1（P＜0.05）抗体水平较对照组小鼠显著升高;而在体外利用库蠓提取物刺激引起致敏小鼠脾细胞显著增殖（P＜0.001）,诱导2型辅助T淋巴细胞（Th2）免疫反应所产生的细胞因子包括IL-4、IL-5、IL-10和IL-13 m RNA表达较对照组显著上调（P＜0.05）。综上成功构建出库蠓-小鼠过敏模型。结论:1.初步明确重庆地区6种库蠓类群的取食偏好,6种库蠓均为兼性吸血,具有吸血多样性的特点,同时不同种群库蠓具有不同的吸血习性。2.利用库蠓提取物,通过两步致敏法成功构建库蠓-小鼠过敏模型,这为进一步深入研究库蠓叮咬过敏及其他过敏疾病机制提供模型工具,同时为吸血昆虫叮咬过敏治疗药物的筛选及开发提供基础。
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