随着化疗药物和治疗方案的优化升级,恶性肿瘤患者预后不断改善,部分患者可以治愈或者长期生存。但化疗药物对女性卵巢功能的毒副作用会在很长时间里影响生育能力,可能引发卵巢早衰,甚至终身严重影响患者的生活质量,生育力保护已然成为当前亟待解决的科学问题和民生问题。阿霉素（Doxorubicin,DOX）被广泛用于医治各种恶性肿瘤,而DOX产生的性腺毒性以及对女性生育力的影响备受关注。在肿瘤的临床治疗中常常采用联合用药治疗,DOX的性腺毒性难以单独评估,其对卵母细胞成熟以及卵巢功能的影响及其相关机制仍然不清楚。本研究利用小鼠卵母细胞和动物模型模拟青春期女性化疗给药,探讨DOX对卵母细胞减数分裂成熟的影响和对卵巢功能的损伤及机制,以期为即将接受抗肿瘤治疗而面临医源性卵巢早衰和生育力丧失风险的患者生育力保护提供新的线索和实验室理论依据。本研究包括2个部分:阿霉素对小鼠卵母细胞体外减数分裂成熟和卵母细胞质量的毒性影响;一次性阿霉素给药28 d后观察其对雌性小鼠发情周期、血清生殖激素、繁殖性能（着床胚胎数量和产仔数）、卵巢组织卵泡发育等生殖活动的影响,以及卵巢组织转录组测序和分析。主要研究结果如下:1.阿霉素对小鼠卵母细胞体外减数分裂成熟的影响（1）小鼠生发泡期卵母细胞经0、10 n M和100 n M DOX持续处理,体外培养14 h。结果发现,100 n M DOX处理显著抑制第一极体排放（Polar body extrusion,PBE）（100 n M DOX组32.9±5.6%,对照组78.5±3.5%,P＜0.0001）,10 n M DOX处理对小鼠卵母细胞的PBE无显著性影响（69.7±9.6%,P＞0.05）。这些结果表明一定浓度的DOX可显著抑制小鼠卵母细胞PBE。（2）纺锤体形态观察结果显示,在100 n M DOX处理14 h不能排放第一极体的卵母细胞中,第一次减数分裂中期（metaphase of Meiosis I,MI）阻滞的卵母细胞比例显著升高（100 n M DOX组46.6±5.5%,对照组10.0±1.8%,P＜0.0001）;剔除未发生生发泡破裂的卵母细胞后,再用DOX处理继续培养12 h,卵母细胞PBE被显著抑制,DOX诱导卵母细胞MI阻滞（100 n M DOX组53.3±3.3%,对照组16.8±2.5%,P＜0.0001）。小鼠生发泡期卵母细胞经100 n M DOX处理8 h后卵母细胞纺锤体结构正常,与对照组卵母细胞的纺锤形面积和长度基本相同,但染色体排列发生紊乱,染色体MI板宽度增大（100 n M DOX组14.54±0.53μm,对照组12.11±0.33μm,P＜0.0001）,染色体宽度与纺锤体长度的比值显著增加（100 n M DOX组0.639±0.025%,对照组0.518±0.019%,P＜0.0001）。以上结果表明DOX处理并未明显影响卵母细胞生发泡破裂,MI纺锤体形态无明显变化,但染色体排列紊乱。（3）观察动粒蛋白CREST和α-tubulin的表达和定位,结果显示DOX处理后MI阶段卵母细胞动粒-微管结构异常的比例显著增加（100 n M DOX组57.9±3.0%,对照组23.9±1.1%,P＜0.0001）。观察体外培养4.5 h和10 h卵母细胞中Bub R1信号,对照组和DOX组pro-MI阶段卵母细胞中Bub R1信号均定位在动粒附近,对照组卵母细胞发育至后期/末期I阶段时Bub R1信号消失,此时DOX组可见MI期阻滞卵母细胞中BUBR1信号持续存在,DOX组中Bub R1活化细胞的比率显著增高（100 n M DOX组73.0±8.6%,对照组25.6±4.2%,P＜0.01）。DOX通过破坏动粒-微管连接,介导纺锤体组装检查点持续激活,阻碍了卵母细胞减数分裂中期向后期的转换。（4）DOX处理后可见DOX在卵母细胞核内积累,采用100 n M DOX处理GV期卵母细胞1～3 h,γ-H2A.X阳性焦点数大于10个的卵母细胞所占比例随着处理时间延长明显增加（P＜0.0001）,造成卵母细胞DNA双链断裂。检测细胞凋亡发现,DOX组卵母细胞Annexin-V荧光强度显著增强（100 n M DOX组19.34±1.06,对照组12.47±1.87,P＜0.01）。继续发育至MII阶段时DOX组卵母细胞中异常纺锤体比例显著增高（100 n M DOX组75.4±1.5%,对照组12.6±2.0%,P＜0.0001）,纺锤体组装受到严重影响,并伴随着染色体排列紊乱。这些结果表明DOX可以直接作用于卵母细胞,并诱导卵母细胞DNA损伤和早期细胞凋亡,干扰MII纺锤体组装,进而损害卵母细胞成熟质量。2.阿霉素对小鼠卵巢功能的影响及转录组测序研究（1）4周龄雌性昆明小鼠经腹腔单次注射10 mg/kg剂量DOX,于21 d后检测小鼠发情周期情况,结果发现,DOX组间情期为1.67±0.45 d,发情周期为5.58±0.48 d,与对照组相比均显著延长（对照组间情期1.17±0.39 d,P＜0.05;发情周期4.25±0.45 d,P＜0.01）。DOX给药后第28 d小鼠血清E2和AMH水平较对照组显著下降（P＜0.01）,FSH水平则显著升高（P＜0.01）。给药28 d后与正常雄性小鼠配种评估雌性小鼠的繁殖性能,结果发现DOX组雌性小鼠配种后10～12 d的胚胎着床位点少且分布不均匀,着床胚胎数及后续产仔数均显著低于对照组（P＜0.05或P＜0.01）,表明DOX干扰小鼠发情周期和激素水平,小鼠卵巢功能受到影响,并导致雌性小鼠生育能力下降。（2）卵巢组织形态学检测发现,DOX给药后小鼠卵巢皮质变薄,髓质扩大,卵泡闭锁,生长卵泡减少。第28 d卵巢组织中初级卵泡和次级卵泡数量显著降低,黄体数量显著减少（P＜0.01）。对卵巢组织进行Masson染色,DOX组切片中胶原面积所占比例显著增高（DOX组6.62±0.98%,对照组3.88±1.07%,P＜0.05）。结果表明,DOX破坏卵巢组织结构,诱导卵巢组织中胶原沉积,卵巢卵泡发育受阻。（3）免疫荧光染色观察,DOX注射24 h后的卵巢有腔卵泡颗粒细胞中可见聚集成团γ-H2A.X亮点或TUNEL阳性荧光信号。透射电镜观察卵巢组织超微结构,结果显示DOX给药28 d后卵巢颗粒细胞的线粒体发生肿胀、空泡化以及线粒体嵴扭曲。这些结果表明,一定剂量的DOX体内给药可严重损伤小鼠卵巢颗粒细胞线粒体,诱导卵母细胞DNA损伤和细胞凋亡,可能导致卵巢卵泡发育异常和闭锁。（4）采用RNA-Seq技术进行转录组测序分析,DOX给药28 d后的小鼠卵巢组织与对照组比对后共获得差异表达基因588个（上调361个,下调227个）,差异表达lnc RNA 266个（上调166个,下调100个）。差异表达基因GO富集分析显示,细胞组分中细胞外区域、细胞外间隙、蛋白质胞外基质等在所有GO条目中富集程度最高,这些区域与卵巢组织和细胞的结构与功能相关;生物学过程中富集程度最高是棕色脂肪细胞分化,涉及突触传递负调节、急性炎症反应、细胞死亡调节等,与细胞分化、机体保护与死亡等有关;分子功能涉及2-酰基甘油O-酰基转移酶活性、蛋白质-精氨酸脱亚胺酶活性、Toll样受体4结合、钙离子结合,提示这些酶和分子在卵巢功能调控中发挥重要作用。KEGG分析结果显示,差异基因显著富集在类固醇激素生物合成、细胞外基质-受体互作、细胞粘附分子、蛋白的消化与吸收以及I型糖尿病和肿瘤等疾病相关通路。差异表达lnc RNA的相邻基因分析显示,在TOP 30 GO条目中包括线粒体翻译的正调节、线粒体小核糖体亚单位、线粒体膜间隙、线粒体核糖体结合等,这些基因显著富集于线粒体等亚细胞器结构与功能。这些结果表明DOX对小鼠卵巢组织细胞外基质、线粒体功能、激素分泌、物质代谢、生长与分化等产生了广泛影响,最终导致卵巢功能下降。（5）分析差异表达基因及其蛋白互作网络,结果发现,DOX组卵巢组织中胶原I、IV、V等表达水平增加,基质金属蛋白酶及其组织抑制因子（MMPs/TIMPs）可能在卵泡发育以及细胞外基质降解和重塑中发挥重要作用。CEBPA和脂肪因子（脂联素、抵抗素和瘦素）表达水平上调,推测CEBPA可能在DOX给药后卵巢细胞代谢和卵泡发育中发挥重要作用。细胞色素P450家族部分成员（CYP1a1、CYP17a1、CYP19a1）表达水平增加,而其他成员（CYP2a5、CYP11b1）、雌激素关键合成酶HSD17b7及雌激素受体ESR2的表达水平降低,表明DOX给药后卵巢细胞在激素合成以及介导雌激素效应中进行了复杂调控。DNA损伤诱导转录因子4（DDIT4）的表达水平升高,提示DOX可能通过DDIT4介导参与细胞内蛋白分子相互作用和卵巢细胞增殖与凋亡的调控。这些基因的表达水平和功能分析,有助于了解DOX造成卵巢损伤及功能修复的可能机制。综上所述,本研究发现一定浓度的DOX处理可导致成熟培养的小鼠卵母细胞发生严重DNA损伤,通过介导纺锤体组装检查点持续活化诱导减数分裂MI阻滞;DOX进一步干扰MII纺锤体组装,扰乱染色体排列,降低卵母细胞质量。一定剂量的DOX给药可引起小鼠体内卵巢颗粒细胞DNA和线粒体损伤,破坏卵巢组织结构,降低卵巢储备,损害雌性小鼠生殖功能。通过RNA-seq筛选差异表达基因以及功能分析,推测MMPs/TIMPs、CEBPA、HSD17b7、DDIT4等可能在DOX给药后调控卵巢细胞外基质、细胞代谢和卵泡发育、类固醇激素合成,以及在DOX诱导DNA损伤后卵巢细胞增殖与凋亡中发挥关键作用。以上研究为理解DOX如何导致卵母细胞减数分裂成熟失败和卵母细胞质量下降,以及卵巢功能损伤提供了重要实验依据,有助于针对因罹患肿瘤需要化疗的年轻女性患者,探讨免受DOX引起的生育能力丧失的策略。