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研究背景及目的:肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,可分为原发性肝癌和继发性肝癌两大类。原发性肝癌即为发生于肝细胞或肝内胆管上皮细胞的恶性肿瘤,90%的原发性肝癌为肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma),而90%的肝细胞癌患者有乙肝病毒(HBV)或丙肝病毒(HCV)感染史。绝大部分肝癌病人最终的死亡原因为肝癌转移。肝癌转移过程中涉及大量基因的表达异常以及相关信号通路的异常。因此,探索这些基因及其参与的相关信号通路在肝癌转移中的作用及其机制,不仅有助于完善我们对肝癌转移分子调控机制的理解,而且也有可能为临床抗肝癌转移提供理论基础和新的治疗靶点。单极纺锤体1结合蛋白(monopolar spindle-one-binder,MOB)基因家族成员在进化上高度保守,是Hippo信号通路的关键组分之一,在细胞增殖、中心体复制、细胞凋亡以及细胞分化等过程中发挥重要作用。迄今为止的研究表明,作为MOB家族成员之一的MOB2,可以通过与MOB1 竞争性地结合NDR1/2(nuclear Dbf2-related kinase 1/2)的N端调控结构域,而影响NDR1/2激酶的活性,调控中心体复制和细胞凋亡等过程。课题组前期研究发现,MOB2可以调控肝癌细胞的迁移,但其具体作用机制尚需要进一步研究。有研究表明,细胞自噬在肝癌的发生、发展和转移过程中发挥重要调控作用,被认为是肝癌细胞迁移、侵袭的重要调控机制之一,但迄今为止有关MOB2与肝癌细胞自噬的研究尚未见报道。本研究主要通过慢病毒介导的MOB2基因干扰表达后,检测MOB2干扰表达对不同转移能力的肝癌细胞迁移、细胞自噬过程的调控作用,并探讨其可能的作用机制。研究方法:1、通过TCGA数据库分析MOB2在肝癌以及癌旁组织中的差异表达以及与肝癌患者生存期的相关性;将100对肝癌组织及其对应的癌旁组织芯片进行免疫组化染色实验,并分析MOB2表达的差异;将7种不同的肝癌细胞系,分别提取总RNA及蛋白质,采用反转录定量聚合酶链式反应(Reverse transcription-quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)及 Western blotting 方法检测 MOB2 的表达水平;2、构建靶向干扰MOB2表达的慢病毒载体;利用HEK293T细胞进行慢病毒包装后,收集慢病毒分别感染低转移能力的SMMC-7721和高转移能力的SK-HEP1两种人类肝癌细胞,通过嘌呤霉素筛选建立稳定干扰表达细胞模型后,采用RT-qPCR及Western blotting验证MOB2的干扰表达;3、应用CCK-8实验、EdU染色实验、细胞克隆形成实验检测MOB2干扰表达对SMMC-7721和SK-HEP1两种肝癌细胞的细胞活力、细胞增殖和克隆形成能力的影响;4、通过细胞划痕实验及Transwell细胞迁移实验研究MOB2干扰表达对两种肝癌细胞迁移能力的影响;5、通过RNA-seq检测及分析MOB2干扰表达细胞中转录组学的改变;采用RT-qPCR实验进行初步验证;6、通过Western blotting实验检测MOB2干扰表达对两种肝癌细胞中EMT相关基因以及细胞自噬相关基因表达的影响;通过自噬流实验检测MOB2干扰表达对肝癌细胞自噬流形成的影响;7、应用Western blotting实验检测MOB2干扰表达对SMMC-7721和SK-HEP1细胞中NDR1/2和YAP表达水平及其活性的影响;8、通过在MOB2干扰表达的肝癌细胞中过表达YAP,采用Transwell细胞迁移实验研究MOB2干扰表达的肝癌细胞中过表达YAP后对细胞迁移能力的影响;应用Western blotting实验检测MOB2干扰表达的肝癌细胞中过表达YAP后对EMT相关基因以及自噬相关基因表达的影响。研究结果:1、TCGA数据库分析结果显示,MOB2在肝癌组织中的表达高于癌旁组织,并与肝癌患者的5年生存期呈负相关(P<0.05);100对肝癌组织及其对应的癌旁组织芯片免疫组化染色实验结果显示,与各自对应的癌旁组织相比,肝癌组织中MOB2表达上调(P<0.05);7种不同转移能力的肝癌细胞系中亦存在MOB2的差异表达;2、Western blotting 及 RT-qPCR 结果显示,SMMC-7721 和 SK-HEP1 两种肝癌细胞MOB2干扰表达细胞模型构建成功;3、CCK-8实验、EdU染色实验及克隆形成实验结果表明,MOB2干扰表达对SMMC-7721和SK-HEP1两种肝癌细胞的细胞活力、细胞增殖及克隆形成无明显影响;4、细胞划痕实验、Transwell细胞迁移实验结果显示,MOB2干扰表达可以显著抑制肝癌细胞的迁移(P<0.05);5、RNA-seq的检测结果显示,与对照组相比,MOB2干扰表达的SMMC-7721细胞中有396个基因表达显著改变。RT-qPCR实验对RNA-seq结果中相关基因表达的验证结果显示,MOB2干扰表达显著下调结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)、富含半胱氨酸血管生成诱导因子蛋白61(cysteine-rich angiogenic inducer 61,CYR61)、SQSTM1/p62 和 N-Cadherin、显著上调 E-Cadherin 和类 unc-51自噬激活激酶 1(unc-51 like autophagy activating kinase 1,ULK1),但对 LC3B 无显著影响。6、Western blotting检测结果显示,与对照组相比,MOB2干扰表达可以显著上调SMMC-7721 和 SK-HEP1 细胞中 E-Cadherin、ULK1 和 LC3BII,显著下调 N-Cadherin和SQSTM1/p62;细胞自噬流实验结果显示,MOB2干扰表达可以促进肝癌细胞的自噬流的形成;7、Western blotting实验结果显示MOB2干扰表达可以促进SMMC-7721和SK-HEP1细胞中NDR1/2及YAP的磷酸化;RT-qPCR实验结果显示MOB2干扰表达可以抑制YAP的转录激活的靶基因CTGF、CYR61的表达;8、MOB2干扰表达的肝癌细胞过表达YAP后,Transwell细胞迁移实验结果显示肝癌细胞的迁移能力增强;Western blotting实验结果表明,过表达YAP的MOB2干扰表达的肝癌细胞中的EMT相关基因表达以及自噬相关基因表达部分逆转。结论:1、MOB2在肝癌组织中广泛表达,并且与对应癌旁组织相比,MOB2表达上调;2、MOB2干扰表达可以抑制不同转移能力的肝癌细胞的迁移并且促进细胞自噬过程;3、MOB2干扰表达可能通过NDR1/2-YAP通路调控肝癌细胞的迁移和自噬。