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菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.）是我国十大传统名花和世界四大切花之一,观赏和经济价值高。花期和花型是菊花的重要观赏性状。大多数菊花品种属于典型的短日照植物,花期直接影响菊花的周年供应和效益;菊花花序是由舌状花和管状花聚集而成的头状花序,舌状花和管状花的形态直接决定着菊花的观赏性。菊花花期和花型形成的分子机制一直是研究的热点和难点。已知光周期路径、年龄开花路径在调控菊花花期中发挥着重要作用,CYCLOIDEA2分支基因与菊科植物舌状花发育有关。但菊花开花、花型形成的复杂分子机制尚有待进一步研究。已知AP2/ERF家族转录因子参与调控植物叶片和花的生长发育。本课题组通过对长日照和短日照条件下菊花转录组分析发现CmERF1在短日照条件下表达量显著升高,但其在菊花开花等过程中的作用并不清楚。为此,本研究从菊花‘神马’中克隆了 CmERF1转录因子,对其调控开花与花发育的功能及调控机制进行了初步探讨,主要内容及结论如下:1.从菊花‘神马’中克隆CmERF1基因,开放阅读框（ORF）长582 bp,编码193个氨基酸,具有保守的AP2/ERF结构域。基于氨基酸序列的系统进化树显示,CmERF1与青蒿AaERF3序列同源性最高,与拟南芥AtERF1序列相似性较高。CmERF1表达受乙烯诱导,在舌状花花冠中表达量最低,在管状花雄蕊中表达量最高,雌蕊中的表达量次之,发现CmERF1在长日照和短日照条件下存在节律表达特性,长日照条件下在进入光照8 h表达量达到峰值,短日照条件下在0h表达量最高。CmERF1无转录激活活性,定位在细胞核上。2.构建了 CmERF1 超表达载体 pMDC43-CmERF1 和干扰载体pMDC32-amiRNA-CmERF1,并进行了菊花遗传转化。CmERF1转基因株系和野生型表型观察发现CmERF1超表达导致菊花花期提前7-10天,干扰株系花期与野生型相比没有明显变化。以CmERF1为诱饵蛋白,筛选菊花‘神马’开花酵母文库,获得了与CmERF1互作的候选蛋白CmTCP2。从菊花‘神马’中克隆了 CmTCP2,该基因ORF长1,326 bp,编码441个氨基酸,含有一个TCP结构域,进化树分析发现CmTCP2和拟南芥AtTCP2亲缘关系最近。CmTCP2无转录激活活性,定位在细胞核中,在叶片和舌状花花冠中表达量较高,表达量响应昼夜节律变化。通过酵母双杂交、烟草双分子荧光互补（BiFC）实验、体外GST pull-down实验,在体内和体外验证了 CmERF1与CmTCP2存在直接互作作用。CmERF1转基因株系转录组分析发现,与野生型相比,光周期路径的开花抑制基因CmCDF2和CmCDF3在超表达株系中显著下调,编码菊花成花素的基因CmFTL3在超表达株系中显著上调,与开花相关的节律基因CmCCA1和CmELF3在超表达株系中显著下调。推测,CmERF1可能通过调控光周期路径基因调控菊花开花。3.与野生型相比,CmERF1超表达株系的最外轮舌状花形成背瓣融合的管状结构,扫描电镜观察结果显示,在5 mm花蕾大小时,超表达株系的最外轮舌状花背瓣出现明显的融合,而干扰株系的融合度较野生型低。CmERF1超表达株系E12和E13舌状花背瓣融合度分别为54.92%和68.97%,显著高于野生型的舌状花背瓣融合度14.60%,干扰株系R4和R12舌状花背瓣融合度分别为11.80%和11.11%。CmERF1超表达株系最外轮舌状花花瓣长度变短,缩短了约23 mm,干扰株系的舌状花长度与野生型相比长度伸长约2-5 mm。原位杂交结果表明,CmERF1主要在管状花的雄蕊和雌蕊中表达,推测其可能调控菊花管状花发育。对CmERF1转基因株系和野生型花蕾的舌状花取样进行基因表达分析,发现与野生型相比,CmERF1超表达株系最外轮舌状花中CmCYC2c和CmCYC2e表达量下调,而干扰株系中其表达量上升。继而克隆了 CmCYC2c和CmCYC2e的启动子序列,元件分析发现CmCYC2e的启动子区存在ERF1结合的DRE/CRT顺式作用元件。通过ChIP-qPCR初步证实了 CmERF1可直接结合CmCYC2e启动子区DRE/CRT顺式作用元件,并不直接结合CmCYC2c。推测,在最外轮舌状花中,CmERF1可能通过直接结合CmCYC2e基因的DRE/CRT顺式作用元件从而抑制其表达,间接抑制CmCYC2c的表达。CmERF1异位超表达可能改变了舌状花中CmCYC2e、CmCYC2c等的表达量,从而使得最外轮舌状花背瓣延伸生长,融合度增加,而腹瓣生长受抑,从而呈现管状花形态。