前言 RASSF1A基因是近年发现的肿瘤抑制基因(Tumor Suppressor Gene，TSG)。研究表明，RASSF1A蛋白参与Ras途径信号传导、DNA损伤修复和诱导凋亡，从而被确定为肿瘤抑制基因。其启动子区高甲基化导致基因灭活，与许多肿瘤，如肺癌、胃癌、乳腺癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、肾癌和前列腺癌等发生有关。由于启动子区高甲基化，基因转录受到抑制，相应蛋白减少或缺失，致使其抑癌作用不能发挥，导致肿瘤发生。这是广大学者公认的观点，甲基化也成为近期研究的热点。鉴于目前国内外尚未见到肾母细胞瘤RASSF1A基因启动子区甲基化报道，我们采用定点检测基因甲基化方法，检测9例肾母细胞瘤，结果报道如下。 方法 收集2001年我院手术切除肾母细胞瘤及相应瘤旁残留肾组织9例，-70℃冰箱中保存备用。用酚/氯仿法提取DNA。紫外分光光度仪检测DNA浓度，选用OD 260/OD 280值大于1.75的样品。采取强碱变性、亚硫酸氢钠/对苯二酚法处理DNA后，用层析柱过柱除盐。巢式PCR扩增RASSF1A基因启动子区DNA片段。应用一对半引物，引物序列如下： ML730：5′-ACCCTCTTCCTCTAACACAATAAAACTAACC-3′； ML561：5′-CCCCACAATCCCTACACCCAAAT-3′； MU 379：5′-GTTTTGGTAGTTTAATGAGTTTAGGTTTTTT-3′。 第一次用引物MU 379、ML730 PCR扩增经亚硫酸氢钠处理的 DNA，用其扩增产物，加引物 MU 379和 ML 561进行第h次扩增，两次扩增条件相同：95℃预变性 4min，进人循环：95 ti min，55T lmin，74T Zmin，30个循环，最后一个循环在 72℃下延伸5 dn。扩增产物送北京奥科公司测序。 结 果 9例中7例未获测序结果，2例测序成功。1例肿瘤组织在1－历个CPG岛甲基化位点中，第2，4，5，9上2，14发生了C＋T转变，这些位点无甲基化；其余10个位点未发生C—T转变，即此位点CPG岛中的C存在甲基化。该例瘤旁残留肾组织M个CPG岛甲基化位点均发生了C—T转变，即16个CpG岛中的C都不存在甲基化；另 1例在第6，9，10，12 CpG岛甲基化位点发生了C—T转变，这些位点无甲基化；其余u个位点存在甲基化；此例瘤旁残留肾组织未获测序结果。两例肿瘤组织存在甲基化位点比较，仅有8个CPG岛位点相同，其余位点不相同。 讨 论 肾母细胞瘤是小儿常见的恶性＼胚胎性肿瘤，因其既有胚胎性遗传改变又有体细胞突变，为肿瘤病因的研究提供了一个良好的模式，一直是研究热点。以往的研究发现，该肿瘤抑癌基因较多，主要与WTI缺失和异常有关，也和V／ttW（候选基因）异常有关。甲基化5！起基因印迹缺失或抑癌基因的失活与肿瘤发生关系密切，如 IGn／H19的基因印迹缺失。抑癌基因启动子区高甲基化使基因失活不能转录，与肾母细胞瘤发生关系密切。现已观察到，该肿瘤中存在抑癌基因甲基化现象，如 PI6基因是一个抑癌基因，在肾母细胞瘤中，P16外显子＊2启动子区存在甲基化，致使P16 ·2·基因不能转录，无蛋白生成，不能抑制肿瘤进展。因而有必要研究RASSFIA基因甲基化情况。 RASSFIA基因是一个抑癌基因。长期以来，人们发现，肺癌。鼻咽癌组织及相应肿瘤细胞系等多种肿瘤，都在3P区域有高频率杂合性缺失、基因片段敲除等异常，并推测在3产’－3产’·‘区间可能存在抑癌基因。在3P’‘”’区定位克隆了包括RASSFIA在内的19个肿瘤抑制基因候选基因，确定在 3产‘·’的一个 Ras效应基因家族一MSSFI，其有 3个转录版本一AJ人。MSSFIA基因 CDNA全长1873hp，编码340个氨基酸的蛋白质。推测其功能：1．参与细胞信号传导，激活Ras途径。2．与DNA损伤修复蛋白一XPA相互作用，参与DNA损伤修复。3．作为细胞生长负向调控子。4．介导凋亡。Ras基因是一个原癌基因，但其效应蛋白家族RASSFI，却有抑癌功能。这是因为，Ras途径被激活，促进细胞生长和转型的同时，Ras蛋白也作用于Ras效应蛋白来诱导生长抑制。并提出了一个假说：驱动细胞死亡及增殖的信号传导路紧密伴随着保护并抑制原癌基因的传导路。这个假说打破了原癌基因、癌基因和抑癌基因的绝对界限。理解Ras基因是如何打破肿瘤的细胞死亡平衡的，对于明确人类肿瘤发生中R％作用是重要的。 目前对 RASSFIA启动子区甲基化检测发现，二例小细胞肺癌全部甲基化；19例鳞状细胞肺癌中7例全部甲基化，余无甲基化；另外，在32个癌细胞系中，甲基化程度较高；而正常组织无甲基化。还有学者研究了肾癌k巢癌、肺癌3腺癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、嗜铬细胞瘤、胃癌、前列腺癌等肿瘤，RASSFIA启动子区均存在高频率甲基化现象，而且在前列腺癌中甲基化程度越高，临床预后越差。 RASSFIA启动子区甲基化是可以逆转的。用甲基化抑制剂 5－Aza－2’脱氧胞昔（5－aza－2’－deoXycytidine，5－Aza－CdR）来处理 A549肺癌肿瘤和 MDAM23乳腺肿瘤细胞系，结果，肿瘤细 ·3