ERK信号通路在痩素促进云锡矿粉诱导大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞转化中的作用及机制

来源 :昆明医科大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:furong99bb
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[目的]探讨ERK信号转导通路在瘦素促进云锡矿粉诱导大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞转化中的作用及机制。[方法](1)选用200μg/ml的云锡矿粉毒染大鼠肺成纤维细胞(RLF-6),每次染毒72h,隔代染毒直至第9代,取第40代活化成纤维细胞和未染毒成纤维细胞常规培养72h后,换无血清培养基继续培养24h收获上清,行细胞因子抗体芯片检测,筛选出表达明显升高的分泌蛋白因子用于后续实验。(2)选用200μg/ml的云锡矿粉毒染大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(RLE-6TN),每次染毒72h,隔代染毒直至第9代,自第10代起常规传代培养直至第20代,自第20代起将R组、R200组细胞与瘦素及MEK抑制剂U0126分组共培养,实验分组如下:RPn组,RPn(L)组,RPn(U)组,RPn(LU)组,R200Pn组,R200Pn(L)组,R200Pn(U)(?)组,R200Pn(LU)组。(3)MTT法检测Leptin对R200细胞活性的影响及U0126对R200细胞增殖的抑制情况,从而选择作用的最适浓度。(4)倒置相差显微镜观察活细胞形态。(5)免疫细胞化学染色检测成纤维细胞活化标志α-SMA表达。(6)刀豆凝集素A凝集实验及锚着独立性生长实验检测上皮细胞转化。(7)Western blot法检测上皮细胞OB-R、ERK表达,以及瘦素作用后上皮细胞ERK1/2信号通路的变化。[结果](1)云锡矿粉毒染活化后的成纤维细胞和正常成纤维细胞分泌蛋白因子有显著差异,活化后的成纤维细胞分泌蛋白因子高于正常成纤维细胞4倍的有45种,显著高于正常成纤维细胞的因子有IL-1sRⅡ(白介素类56.2423918098168倍)、IFN-alpha/beta R2(肿瘤坏死因子13.7478335292349倍)、MIP-3beta(趋化因子15.7099528914114倍)、Leptin/OB(其他因子17.8315596608074倍)。(2)MTT结果显示,不同浓度瘦素作用相同时间后,各组细胞与对照组比较,增殖效应明显升高,且对照组与各组之间OD值差异有统计学意义p<0.05)。在0-100ng/ml之间,瘦素浓度越高,细胞增殖越明显;当瘦素浓度达100ng/ml时,其促增殖效应最显著;在100-1000ng/ml范围内,瘦素浓度与细胞增殖相关性减弱,细胞增殖趋于稳定。100ng/ml作用组与高浓度Leptin作用组相比,差异无统计学意义p>0.05);同一浓度作用12h与作用24h之间差异无统计学意义p>0.05),而同一浓度作用12h与48h、24h与48h之间差异均有统计学意义(p<0.05)。随着U0126浓度的增加,对细胞的抑制率明显增加,呈剂量依赖性。U0126作用30min、1h后吸出药物继续培养24h、48h,10μmol/L组、20μmol/L组、DMSO组与对照组比较差异均无显著性(p>0.05);30、40、50μmol/L组与对照组相比差异有显著性p<0.05),但各两组之间相比差异无显著性(p>0.05)。U0126作用30min、1h后吸出药物继续培养72h,各浓度药物组对细胞的生长均有显著抑制作用,但各组之间相比差异无显著性(p>0.05)。20μmol/LU0126作用1h后吸出药物继续培养72h与该浓度作用12h后吸出药物继续培养12h比较,差异无显著性(p>0.05)。(3)正常RLE-6TN细胞边界清晰,细胞核呈圆形位于细胞中央,约占细胞总面积的1/3左右;当细胞大量增殖时,细胞相互融合,呈铺路石状生长,细胞核也由圆形变为卵圆形。R细胞经过200μg/ml云锡矿粉作用后,自第35代后的R200细胞形态逐渐由多边形转变为多角不规则形,继而转变为短梭形。(4)云锡矿粉诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞后,R200Pn组细胞培养至第40代呈恶性转化特征,凝集实验阳性,其克隆形成率仅为2.00±0.82%o;自第20代开始与Leptin、U0126共培养后,R200Pn(L)组恶性转化时间提前,凝集实验阳性,R200P40(L)组细胞克隆形成率高达18.25±0.96%o,R200P40(LU)组克隆形成率为4.33±1.03%o,RPn组,RPn(L)组,RPn(U)组,RPn(LU)组、R200Pn(U)组细胞一直培养至40代未见恶性转化特征。(5)经矿粉隔代毒染的成纤维细胞a-SMA表达阳性。(6)肺泡Ⅱ型上皮细胞存在OB-R及ERK表达,各组上皮细胞ERK表达无显著差异,当经矿粉及Leptin作用后,R200P35、R200P35(L)、R200P35(LU)组细胞内p-ERK活化水平增加,其中p-ERK活化水平R200P35(L)组>R200P35(LU)组>R200P35组,与RP35组相比差异均有统计学意义。MEK抑制剂U0126作用组R200P35(U)组细胞内p-ERK升高水平受到抑制。[结论](1)云锡矿粉能诱导成纤维细胞活化,其分泌因子与正常成纤维细胞存在明显差异;(2)矿粉能通过激活ERK1/2信号通路诱导上皮细胞转化。瘦素单独处理不能诱导上皮细胞转化,但其能够进一步提高ERK活性加速矿粉诱导的上皮细胞转化。其可能是活化成纤维细胞促进矿粉诱导上皮细胞转化的机制之一。
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