扦插生根率低是制约利用扦插进行无性系林业发展的瓶颈,因此,提高难生根植物插穗生根率和生根质量成为研究的热点。落叶松是我国重要速生用材和生态造林树种,属难生根植物。目前,对落叶松扦插生根的研究虽然已在生理生化水平上取得一定进展,但其生根机理仍不清楚。开展本项研究,为探索落叶松插穗不定根发育的分子机制奠定理论基础。本研究以杂种落叶松全同胞无性系为实验材料,从对插穗不定根发育的解剖学观察及内源激素分析入手,利用蛋白质组学技术研究不定根发育过程中蛋白差异表达及其功能,采用基因克隆技术获得部分蛋白全长基因并进行转录水平上的表达分析,探讨落叶松插穗不定根发育的分子机制。主要结果如下:1插穗不定根形成方式及发育关键时期通过对落叶松插穗不定根发育过程中外观形态和解剖观察发现,不定根原基发生于髓射线正对的形成层部分,属于诱导生根型。不定根发育的完整周期大约55-60天,其中扦插第14-18天、25-30天、35-40天是不定根发育的三个关键时期,分别是不定根诱导期、不定根原始细胞形成期、不定根原基形成伸长期。2内源激素与插穗生根性状的关系及复合激素的互作效应通过对不同无性系及IBA处理下同一无性系插穗不定根发育过程中内源激素含量的测定,认为采穗母株的激素水平,尤其是IAA和ABA,影响不同无性系插穗的生根性状,IAA越高、ABA越低,有利于生根;外源IBA对插穗不定根发育的促进作用主要是显著提高不定根诱导之前IAA含量、抑制ABA含量。不同无性系和IBA处理下同一无性系插穗不定根发育过程中IAA+GA+ZR /ABA的变化与最终生根性状一致,可以作为衡量插穗生根好坏的指标。通过测定复合激素处理下四类激素含量的变化,认为激素之间存在互作效应。与单独使用IBA相比,IBA+6BA和IBA+GA表现出增效作用,IBA+ABA表现出拮抗作用。因此,在生产中可以加入适当浓度的细胞分裂素或赤霉素配合生长素使用,可以更好地发挥促进生根的作用。3 LKCcO6b和LKMDH在插穗不定根发育过程中发挥调控作用通过对不定根发育过程中参与三羧酸循环和线粒体电子传递的两个关键蛋白LKMDH和LKCcO6b在蛋白及转录水平的分析,认为他们主要在不定根诱导期发挥调控作用,IBA诱导下蛋白和mRNA两个水平均上调表达,为此期髓射线和正对髓射线形成层的细胞分裂和新细胞的合成提供碳骨架和能量来源,促进不定根原始细胞的形成。通过对复合激素处理下LKCcO6b和LKMDH表达水平分析,认为适当浓度的细胞分裂素或赤霉素能增效生长素对LKCcO6b和LKMDH的调控作用,而脱落酸拮抗该作用。这与复合激素对内源激素水平的影响效果一致,表明LKCcO6b和LKMDH在不定根的形成发育过程中起到调控作用。4插穗不定根发育的分子机制通过对不同无性系(不同基因型)和IBA诱导下同一无性系(相同基因型)插穗不定根发育关键期差异表达蛋白功能分析,认为插穗不定根发育的分子机制表现在以下两个方面:1)碳和能量代谢调控不定根形成发育。无论是不同无性系还是IBA诱导下同一无性系插穗不定根发育过程中都能鉴定到大量碳和能量代谢相关蛋白,这些蛋白在生根较好的无性系或IBA处理下显著上调表达,尤其是在不定根诱导期,为形成层细胞分裂和新细胞合成提供稳定的碳水化合物和能量来源,促进不定根原始细胞的形成。2)信号转导调控不定根的形成发育。从不同无性系和IBA诱导下同一无性系插穗不定根发育过程中鉴定到生长素信号转导相关蛋白,这些蛋白在生根较好的无性系或IBA处理下显著上调表达。不定根诱导前期,内源IAA出现瞬时高峰,高于生长素信号转导中IAA的阈值;同时泛素降解相关蛋白上调表达,降解生长素信号转导途径中的抑制因子,共同促进IAA信号转导通路中下游基因的表达,调控不定根的形态建成。综上所述,落叶松插穗不定根形成和发育是一个非常复杂的多基因调控过程,上述研究结果为探索落叶松插穗不定根发育机制奠定理论基础,同时为其他针叶树不定根发育研究提供参考。