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背景与目的脊髓性肌萎缩症(Spinal Muscular Atrophy,SMA)是一种常染色体隐性遗传性神经系统疾病,I型多于婴幼儿时期起病。病理特征主要为选择性脊髓前角α运动神经元变性,临床表现为进行性对称性肢体无力及肌肉萎缩。主要致病基因为位于染色体5q13区域的运动神经元生存(survival motor neuron,SMN)基因,包含两个高度同源的基因SMN1和SMN2,两者在全长只有少数单碱基的差异。临床上95%的SMA病人是由于SMN1基因纯合缺失,剩余5%可呈微小突变。由于碱基上的差异,SMN1基因编码全长的转录本,而SMN2基因转录的pre-mRNA易发生7号外显子的剪接跳跃,产生截短的SMN(SMNΔ7)转录本。在SMN2基因7号内含子中有两个作用显著的内含子剪接沉默子ISS-N1和ISS+100,相关文献报道8号外显子3’剪接位点(ex8 3’ss)在剪接中也发挥着重要的作用。CRISPR-Cas9系统是一种发现于细菌和古生菌中的免疫系统,1987年,日本学者在E.coli K1的碱性磷酸酶基因编码区的附近首次发现了成簇的规律间隔的短序列,在抵抗外来病毒、质粒等过程中逐渐演化形成的获得性免疫防御机制。该系统可在sgRNA的引导下切割DNA,DNA双链被切割开后细胞自身存在的DNA损伤修复的应答机制可使dsDNA断裂的上下游两端的序列连接起来,若导入了同源模板,断链处发生同源重组(Homology directed repair,HDR),达到修正基因的目的。若没有同源模板,则通过可能会引起插入或者删除错误的非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)方式修复,破坏该段DNA序列。本研究分为三部分,第一部分为SMA患者致病性点突变的鉴定及其对SMN1基因剪接影响的验证。第二部分报道了以罕见遗传方式传递SMN1基因突变的SMA家系。第三部分应用CRISPR/Cas9系统对SMA小鼠模型进行胚胎治疗,通过sgRNA引导Cas9核酸内切酶定位于SMN2基因8号外显子3’剪接位点的DNA序列上,破坏该处DNA序列。方法1.采用Sanger测序、聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)、多重连接依赖性探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)、聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性(PCR-RFLP)、T-A克隆测序结合基因组序列分析进行SMN基因拷贝数和点突变分析,同时鉴定患者父母基因型,分析明确突变的传递关系。2.构建minigene,将pCI-minigene SMN转染入293T细胞中过表达,诱导点突变c.835-5 T>G的pCI-minigene SMN1,同时以pCI-minigene SMN1、pCI-minigene SMN2作为对照提取RNA行逆转录PCR(Reverse Transcription PCR,RT-PCR)。提取病人一家外周血RNA行RT-PCR,以正常人为和SMA病人为对照进行分析。3.构建靶向于SMN2基因8号外显子3’剪接位点的Cas9-sgRNA筛选出的切割效率高的sgRNA,运用显微注射技术将Cas9 mRNA和sgRNA注射入SMA小鼠受精卵,观察经基因编辑后SMA I型小鼠寿命、体重、尾长、翻正反射的变化。结果1.第一部分SMA I型患者携带一拷贝的SMN1且存在c.835-5 T>G突变。转染pCI-minigene SMN1 c.835-5 T>G的细胞其minigene全长mRNA的表达量较转染pCI-minigene SMN1细胞显著下降。外周血RNA分析,病人FL-SMN转录本的表达水平相比其父母及正常对照明显减,Δ7-SMN转录本的表达水平升高。病人FL-SMN转录本含量低于其父母及正常对照,与SMA病人相似。差异均具有统计学意义。2.第二部分中SMA I型患者携带一拷贝SMN1且存在点突变c.844 C>T。在该家系中,先证者的母亲与另一例患者的父亲SMN1的拷贝数均为2,但携带c.844C>T突变位点。他们各自配偶均为SMN1单拷贝的携带者。3.第三部分胚胎干预后出生的SMA I型小鼠(8ss-SMA I)寿命(观察已超过50天)、体重及鼠尾长度增加,运动功能也得到了改善。结论本研究的第一部分证明了c.835-5 T>G突变可引起SMN1基因大部分转录本的7号外显子跳跃,并导致一例SMA I型患者。第二部分中该家系的遗传方式罕见,而且c.844 C>T位点造成酶切假阳性的结果,提示在SMA临床诊断中,有必要联合应用限制性酶切、MLPA以及测序等多种技术,以提高本病基因诊断的准确率。本研究第三部分在SMA I型小鼠胚胎上,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对SMN2基因8号外显子3’剪接位点进行破坏,治疗效果较好,破坏效率较高,为今后SMA的基因编辑治疗提供新的靶向位点。