论文部分内容阅读
神经坏死病毒(nervous necrosis virus,NNV)是多种海水养殖鱼类的病原,容易感染稚鱼和幼鱼。其导致的病毒性神经坏死病死亡率高,给养殖业带来了巨大的经济损失。对该病的治疗还没有有效的药物和疫苗,因此开发简便、灵敏度高、特异性强的快速检测NNV的方法非常重要。本文针对赤点石斑鱼神经坏死病毒,设计了特异性引物,建立了交叉引物等温扩增体系,并对该方法的Mg2+浓度、d NTPs浓度、反应温度三个重要参数进行了优化。优化后的反应体系为:5 mmol/L Mg Cl2、1.2 mol/L Betaine、1.2 mmol/L d NTPs、1.6μmol/L引物1a、0.8μmol/L引物2a/3a、0.2μmol/L引物4s/5a、10×Thermo Pol Buffer 2.5μL、Warmstart Bst DNA聚合酶8 U、M-MLV反转录酶28 U以及适量的RNA模板,DEPC水补足至25μL。优化后的反应参数为69oC保温60 min,然后80oC保温5 min终止反应,最后采用切向流试纸条通过肉眼判断检测结果。该方法的检测极限为101copies/μL RNA模板,比常规RT-PCR高10倍,与荧光定量RT-PCR灵敏度相当。该方法反应特异性良好,与病毒性出血性败血症病毒(VHSV)、传染性胰脏坏死病毒(IPNV)、大菱鲆红体病虹彩病毒(TRBIV)、淋巴囊肿病毒(LCDV)、哈维氏弧菌(Vibrio.harveyi)、鳗弧菌(V.anguillarum)等多种鱼类病原均无交叉反应。使用该方法对实际样品进行检测,与LAMP试剂盒方法相比较,更容易分辨阴性和弱阳性。本实验所建立的赤点石斑鱼神经坏死病毒交叉引物等温扩增联合切向流试纸条方法(CPA-LFD)简单、快速、灵敏度高且特异性强,可以广泛用于疾病的现场快速诊断。近年来,表面增强拉曼光谱(SERS)用于基因的检测越来越受到研究者们的关注。本研究还为快速检测鱼类神经坏死病毒,设计了病毒特异性的发夹型探针,经硫醇修饰后与纳米银溶胶结合,制备了鱼类神经坏死病毒纳米探针(Ag-NNV),并使用透射电镜、多功能酶标仪、表面增强拉曼光谱仪等对纳米探针Ag-NNV的表征及发夹型探针在纳米银粒子表面的覆盖率进行了测定和分析。结果表明,裸露的纳米银粒子为球形,平均直径50 nm;制备的纳米探针颗粒为球形,平均直径90 nm。纳米银粒子和纳米探针在溶液中均具有良好的分散性。平均每个纳米银粒子表面结合发夹型探针约100条,单位表面积的探针覆盖量为0.56 pmol/cm2。该纳米探针制备简便,适合用于表面增强拉曼散射法对鱼类神经坏死病毒进行快速检测。