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实验背景:
1960年， Jennings首次提出了心肌缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion，I/R)的概念，即心肌缺血后再灌注时，不仅未使组织器官功能恢复，反而将缺血所致的器官功能代谢障碍和组织结构破坏进一步加重的现象。随着“缺血再灌注损伤”这个概念提出以来，缺血再灌注损伤的机制越来越受到关注。细胞内钙代谢紊乱、氧自由基的产生和中性粒细胞浸润是造成心肌缺血再灌注损伤的三个主要途径。1972年Shen和Jennings[2]发现犬心脏冠状动脉短暂闭塞后复灌可加速细胞内钙离子的积聚，并首次提出钙超载学说，人们自此将Ca2+在缺血再灌注损伤中的作用当作研究的热点。钙超载对于心肌缺血再灌注的损伤包括:线粒体功能障碍;激活Ca2+依赖性磷脂酶，促进磷脂酶分解;促进氧自由基形成;引起心律失常。枸橼酸又名柠檬酸，枸椽酸根离子可与血中钙离子生成难解离的可溶性络合物枸椽酸钙，此络合物易溶于水但不易解离，降低血清钙离子浓度。假设枸橼酸可能通过影响细胞外的钙离子参与心肌I/R损伤，从而可能产生心肌保护作用。本实验采用大鼠在体心肌缺血再灌注模型，观察枸橼酸对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响，探讨枸橼酸预处理是否在大鼠心肌I/R中有减轻损伤的作用。
实验目的:
1.研究枸橼酸预处理在大鼠心肌缺血再灌注中减轻损伤的作用。
2.为临床研究及干预心肌缺血再灌注病理过程提供新的思路及靶点。
实验内容和方法:
采用体重为350-400g的健康雄性SD大鼠，建立大鼠在体缺血再灌注模型实验模型（结扎冠状动脉30min，再灌注120min），本实验从五个方面进行研究:
1.枸橼酸对大鼠在体I/R模型心律和血流动力学的研究:健康雄性大鼠随机分为5组，每组动物10只，各组经尾静脉于再灌前10分钟给药，记录分析再灌注后120min室性心律失常和血流动力学的变化。
2.枸橼酸对大鼠血清Ca2+影响的研究:观察在体大鼠给予0.05 mol·L-1枸橼酸后给药前和给药后5min、10min、15min、30min的颈动脉血样，观察枸橼酸对血清Ca2+的影响，以探讨枸橼酸作用的可能机制。
3.枸橼酸对大鼠心肌细胞损伤的研究:利用大鼠在体缺血再灌注模型，再灌注120min末，采用Evans蓝与TTC染色的方法测量缺血区及梗死区面积;再灌120min末以左心室心肌组织蛋白Capase-3活性为检测指标，检测枸橼酸预处理在大鼠心肌缺血再灌注损伤中Capase-3蛋白活性的变化。
4.枸橼酸对缺血再灌注大鼠体内内源性感觉神经肽（SP、CGRP）表达的影响:再灌注120min末提取各实验组左心室心肌组织蛋白，利用酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)，对Sham组、I/R组以及枸橼酸预处理组的左心室心肌组织中的SP、CGRP进行检测。
5.枸橼酸对缺血再灌注大鼠超氧化物歧化酶(SOD)的半定量分析:再灌注120min末提取各实验组左心室心肌组织蛋白，采用蛋白免疫印迹(western-blot)方法分析各实验组SOD的含量，探究枸橼酸是否提高氧自由基清除酶的活性。
实验结果:
1.枸橼酸对在体大鼠心肌缺血再灌注引起心律失常及血流动力学的影响
1.1 心律失常再灌注期:与Sham组比较，I/R组发生室性心律失常发生数目明显增多(P＜0.01);与I/R组比较，给药组再灌注120min室性心律失常发生有下降的趋势，其中0.05M组有显著性降低(P＜0.01)。从时间分布看，枸橼酸下调室性心律失常的作用高峰主要集中在再灌注早期（20min内）。
1.2 血流动力学与Sham组比较，IR组的收缩压、舒张压、平均压在再灌注后前30min降低明显(P＜0.05);和I/R组相比，枸橼酸预处理组的收缩压，舒张压以及平均动脉压均有下降趋势;脉压差略有升高;心率变化略小，但均无统计学差异。
2.枸橼酸对大鼠血清钙的影响:
用药后5min的血清钙离子浓度与用药前比较降低7.64％(P＜0.001);用药后10min显著下降了20.52％(P＜0.05);用药后15 min下降18.70％，但无统计学意义;用药后30min，血清钙回升4％。提示枸橼酸在用药10min螯合血清钙离子的能力达到高峰。
3.枸橼酸对大鼠心肌损伤的影响:
3.1 与I/R组相比:枸橼酸预处理组再灌注120min后缺血区心肌AAR/LV都有减少，其中0.05M组缺血面积减少了34％(n=6，P=0.01);枸橼酸预处理组再灌注后IS/AAR均显著减少40％以上(n=6，P＜0.05);枸橼酸预处理组再灌注后IS/LV都有减少，其中0.05M组显著缩小68％(n=6，P＜0.01);
3.2 与Sham组比较，IR组明显活性增加(P＜0.01);与I/R组相比，Caspase-3活性在给药组都有下降趋势，其中0.05M组降低最明显(P＜0.01);与0.05M组比较，给药组内都有统计学差异（0.1M组P＜0.01，0.01M组P＜0.01），但无剂量依赖性。
4.枸橼酸对大鼠内源性P物质、降钙素基因相关肽的影响
4.1 SP-ELISA结果:
与I/R组相比，0.05M组在再灌注后心肌组织中SP递质表达显著上调24％(P＜0.05)，而0.1M组SP的表达明显下降41％(P＜0.01)。
4.2 CGRP-ELISA结果:
与Sham组相比较，IR组CGRP表达增多(P＜0.05);与I/R组相比，给药组再灌注后的CGRP表达量均下降，其中0.05M组降低34％(P＜0.05);组内比较0.05M组下降最显著(P＜0.05)，但未发现剂量依赖性。
5.SOD-Western Blot结果:
和Sham(0.85±0.08)组相比，IR组(0.78±0.04)的SOD活性降低;与I/R组相比，给药组0.01M组(1.20±0.12)、0.05M(1.30±0.12)、0.1M组(1.16±0.12)明显增加了SOD的释放量，提高了氧自由基的清除力，有统计学意义(P＜0.05)。
实验结论:枸橼酸预处理对缺血再灌注大鼠心肌具有保护作用，其降低大鼠心律失常的严重程度，限制梗塞范围的作用，以0.05M剂量组的作用效果更佳;枸橼酸通过下调Caspase-3蛋白表达，降低缺血再灌注后大鼠心肌细胞凋亡指数发挥抗细胞凋亡作用;初步证明枸橼酸预处理可减轻心肌缺血再灌注损伤，具有心肌保护作用。同时感觉神经肽介入了枸橼酸预处理的心肌保护。