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前言:喉癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一,占全世界癌症相关死亡的1%。其中,鳞状细胞癌约占喉癌病例的90%,中晚期阶段常伴有局部浸润和远处淋巴结的转移,是喉癌患者主要死因之一。虽然治疗手段不断进步,但是喉癌患者五年生存率仍不乐观,因此,深入研究喉癌转移的分子机制,寻找新的分子靶点对于喉癌的诊断、治疗和预后评估具有重要意义。前期,通过电子杂交等技术我们发现并克隆了MYCT1基因。研究表明,MYCT1抑制肿瘤细胞增殖、克隆形成和迁移并促进肿瘤细胞凋亡,在喉癌等肿瘤发生发展中发挥重要抑癌基因作用。此外,经二代测序我们在过表达MYCT1喉癌细胞中发现miR-362-3p等基因表达水平存在显著差异,提示miR-362-3p是MYCT1的下游调控基因。miR-362参与妊娠糖尿病、表皮细胞衰老、动脉粥样硬化及肿瘤等人类多种疾病的发生发展。研究表明,miR-362-3p在肾细胞癌和胃癌细胞的迁移中发挥重要作用。然而,miR-362-3p在喉癌中的作用和分子机制相关研究未见报道。通过TargetScan和Starbase等软件预测,我们发现醛缩酶A(ALDOA)是miR-362-3p的潜在靶基因之一。研究表明,ALDOA在包括胰腺癌、肺癌、结肠癌、胃癌和肾癌等多种肿瘤中表达异常且与肿瘤细胞的迁移转移有关,然而,其在喉癌中表达和作用研究尚不清楚。本研究中,我们拟运用相关分子生物学技术检测miR-362-3p在喉癌中表达水平、临床意义及其对喉癌细胞迁移侵袭能力的影响,预测miR-362-3p的潜在靶基因ALDOA,研究其是否通过ALDOA参与喉癌细胞的迁移侵袭,为寻找喉癌早期诊断和预后判断生物标志物提供线索。材料与方法 一、实验材料1、细胞系:人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞系、人胚肾HEK293细胞、人咽鳞癌细胞系FADU、人喉癌细胞TU212。2、组织标本:收集2015年1月至2017年11月新鲜喉癌及相应癌旁正常组织标本50例,由解放军463医院耳鼻喉科提供,术后立即将组织置-80℃冰箱保存。所有组织标本均经病理医生证实,并获得患者相关临床资料信息。本研究经中国医科大学医学伦理委员会批准,并获得患者知情同意。二、实验方法1、细胞培养2、基因瞬时转染实验3、qRT-PCR检测4、Western blot检测5、细胞划痕实验6、Transwell小室检测法7、临床资料分析8、统计分析实验结果:1、qRT-PCR结果显示,miR-362-3p在喉癌组织中的表达水平较癌旁组织显著升高(P<0.05);同时,miR-362-3p在喉癌Hep2细胞中的表达水平较HEK293细胞显著升高(P<0.05)。提示miR-362-3p在喉癌中可能发挥癌基因作用。2、单因素方差分析结果显示,与对照组相比,miR-362-3p在淋巴结转移和较高级别临床分期的喉癌患者癌组织中表达水平显著上调(P<0.05),而在不同年龄、性别、分化程度和浸润深度癌组织中表达水平无显著差异(P>0.05),提示miR-362-3p与喉癌的恶性程度有关。3、qRT-PCR结果显示,miR-362-3p在转染miR-362-3p mimic或miR-362-3p inhibitor的Hep2细胞中表达水平较对照组(nc)分别显著升高或降低(P<0.05),证明转染成功。Transwell小室检测和细胞划痕实验结果表明,miR-362-3p mimic转染组中Hep2细胞迁移数量和迁移距离较对照组(nc)显著增加(P<0.05),miR-362-3p inhibitor转染组中Hep2细胞迁移数量和迁移距离较对照组(nc)显著减少(P<0.05),提示miR-362-3p促进Hep2细胞迁移。4、Targetscan和Starbase等软件预测结果显示,ALDOA的3’-UTR区存在miR-362-3p的结合位点,提示ALDOA可能是miR-362-3p的潜在靶基因之一。qRT-PCR和Western blot结果显示,miR-362-3p mimic转染组中ALDOA在Hep2细胞中的表达水平较对照组(nc)显著降低(P<0.05),miR-326-3p inhibitor转染组中ALDOA在Hep2细胞中的表达水平较对照组(nc)显著升高(P<0.05)。此外,ALDOA在喉癌Hep2细胞中的表达水平较HEK293细胞显著降低(P<0.05)。以上结果提示ALDOA可能是miR-362-3p的靶基因。5、Western blot结果显示,ALDOA在转染siALDOA的Hep2细胞中表达水平较对照组(nc)显著降低,提示转染成功。Transwell小室检测和细胞划痕实验结果表明,siALDOA转染组中Hep2细胞的迁移数量和迁移距离较对照组(nc)显著增加(P<0.05),共转染siALDOA和miR-362-3p inhibitor组中Hep2细胞的迁移数量和迁移距离较对照组(nc)无明显差异(P>0.05),提示siALDOA可以回复miR-362-3p inhibitor对喉癌细胞迁移的影响,表明miR-362-3p通过ALDOA影响喉癌细胞的迁移。结论:1、miR-362-3p在喉癌中发挥癌基因作用,其表达水平与喉癌恶性程度有关。2、miR-362-3p促进喉癌细胞的迁移。3、ALDOA可能是miR-362-3p的靶基因。4、miR-362-3p部分通过ALDOA促进喉癌Hep2细胞的迁移。