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无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)为一类革兰氏阳性球菌,依据兰氏分群法归为B群,β溶血,多呈长链状。作为一种人畜共患病原菌,它不仅能感染新生儿和未孕成年人。近年来,罗非鱼感染无乳链球菌带给养鱼业巨大的经济损失。我国是水产养殖业产量的大国,水产品对现今社会人们的吸引力也越来越大,无乳链球菌对罗非鱼的致病机理由于其多因素性、多途径性及多机制性等特点,增加了防治的难度,应用有效疫苗防控罗非鱼的无乳链球菌病,实现疫苗的效果最优化和副作用最小化,鱼源株无乳链球菌GD201008-001特有毒力岛的研究有助于阐明其致病机制。1罗非鱼源无乳链球菌灭活苗免疫效果研究将罗非鱼源无乳链球菌GD201008-001连续传代至50代,其各代次间生化特性分别采用API20 Strep生化鉴定试剂条和全自动生化分析仪进行比较鉴定;将灭活苗以5×108CFU/尾分别肌肉注射和腹腔注射30g±5g的罗非鱼,第三次免疫后14d,以50倍LD50对其攻毒,记录死亡情况;在免疫的不同时间里用试剂盒检测罗非鱼肝脏的各个酶活指标,用RT-PCR法检测头肾中IL-lβ的表达量,分析其免疫保护效果。该菌各代次间生化特性稳定;免疫组肌肉注射和腹腔注射的免疫保护率分别为83.97%和93.33%,说明该灭活疫苗对罗非鱼抵抗高浓度的无乳链球菌感染具有很好的免疫保护性,可以作为预防无乳链球菌感染的候选疫苗。在免疫前后多数酶活指标并没有显著性差异(P>0.05),一免后42dIL-lβ的表达均显著高于一免后14 d,并且肌肉注射方式显著高于腹腔注射(P<0.05),而超氧化物歧化酶、溶菌酶、总抗氧化能力、过氧化氢酶活力在腹腔注射时高于肌肉注射,说明腹腔注射灭活苗的免疫效果更好。2无乳链球菌GD201008-001 DNA结合蛋白XtgS缺失株的构建及其生物学特性分析在前期研究中发现在鱼源无乳链球菌GD201008-001 10kb特有基因岛中含一个DNA结合蛋白XtgS,其功能未见报道。本试验针对该XtgS基因进行无痕缺失,采用同源重组的方法,并利用链球菌-大肠杆菌穿梭质粒pSET4s,构建缺失质粒pSET4s-XtgS,经电转后,将质粒导入感受态细胞中,经过温度和抗性双重筛选,确定XtgS基因的缺失株△XtgS。缺失株经mRNA水平验证,确定构建成功。生物学性状研究发现,△XtgS缺失株与野生株相比较,在镜检下,其染色形态上无明显差异,但生长速度略慢,两者对常用抗生素的最小抑菌浓度无明显差异,对HEp-2和bEnd.3细胞的粘附率无明显差异。对于ICR小鼠,在体内和体外的试验都显示:短时间内缺失株的增殖比野生株快,但出现死亡之前小鼠体内野生株与缺失株的细菌含量与分布都较为接近,菌含量在血液中较多,其次是脑。血清中炎性细胞因子TNF-a的表达缺失株组略高于野生株组。以上结果显示,△XtgS缺失株构建成功,且使细菌毒力有所增强,XtgS基因可能是调控GD201008-001毒力基因表达的负转录调节因子,其机理还有待于进一步的研究证实。3无乳链球菌鱼源株GD201008-001和人源株A909特性的比较经过比较基因组分析,发现鱼源株GD201008-001和人源株A909的基因组序列及元件高度相似,可以从多个角度对这两株菌进行比较。本试验比较了实验室保存的这两株菌,进行了一系列试验比较其生物学特性的差异,比如细菌形态、生化特性和生长曲线。通过在小鼠和罗非鱼血中的存活及对斑马鱼的LD50的测定比较了两株菌的毒力,以肌肉注射的途径对小鼠进行攻毒,取0.5 h、lh、3 h和24h的肌肉注射部位组织制备病理切片,设置空白对照。结果显示两者的细菌形态和生化特性无明显差异,而A909生长较快,对斑马鱼的LD50显著高于GD201008-001(P<0.05)。除罗非鱼全血试验的1.5h时间点外,A909的存活率均显著高于GD201008-001(P<0.05)。肌肉组织病理切片的HE染色镜检结果显示,随着时间的推移,炎性细胞、血细胞和细菌的渗出及组织的自溶现象逐渐增加,GD201008-001攻毒的现象比A909强烈。鱼源株和人源株虽然基因序列相似,但是对小鼠和斑马鱼的毒力都存在显著差异,其差异的具体分子机制还有待进一步研究。