研究背景：　　射频消融（Radiofrequency ablation，RFA）技术因其创伤小，可重复性及有效性被广泛用于治疗肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）。对于直径小于3厘米的肝癌，RFA已成为临床的主要治疗方法。然而，在治疗直径3-5 cm的肝癌时，射频消融技术具有明显的局限性。随着肝癌直径的增加，射频技术对病灶的完全消融率明显下降，1年复发率急剧增加。热沉效应被认为是影响消融形状及体积的主要原因，肿瘤内或周边大血管的血流在射频消融的过程中会造成热量损失。因此如何在肝癌消融过程中，获得足够大的消融体积是目前射频消融技术亟待解决的问题。　　当前，获得较大消融范围的策略之一为在射频消融治疗前首先对肿瘤的血流灌注进行阻断。经导管动脉化疗栓塞（Transcatheter arterial chemoembolization TACE）或经动脉导管栓塞技术（Transcatheter arterial embolization TAE）已被用于联合RFA治疗肝脏肿瘤，其完全消融率及长期生存率均得到改善。近年来，微泡增强的超声空化（Microbubble-enhanced ultrasound，MEUS）已经被用于抗肿瘤血管治疗，MEUS诱导的瞬态空化效应，可以严重毁损肿瘤微小血管，暂时性阻断肿瘤微循环，这可能为RFA提供一个减少热沉效应的机会。本课题组前期研究中，利用MEUS增强了正常兔肝经皮乙醇消融（Percutaneous ethanol ablation PEA）体积约10倍；使大鼠Walker-256肿瘤PEA消融率从81%提高到97.5%。　　研究目的：　　本研究设想将MEUS应用于暂时阻断兔肝血流，减少RFA治疗过程中的热沉效应，从而增强新西兰大白兔兔肝消融体积。　　材料与方法：　　1．实验仪器：　　（1）数字化超声空化治疗仪：CZ960型，绵阳索尼克电子有限公司生产。探头换能器的工作频率为831 kHz，脉冲宽度为400周期，脉冲重复频率设定为9Hz，声压（峰值负压）输出为4.3 MPa，超声发射实际占空比为0.22%，对应的声强（ISPTA）为1.35 W/cm2。　　（2）飞依诺超声诊断仪：VINNO 70，苏州飞依诺科技有限公司生产，配备9 L线阵探头（频率范围4-12 MHz）。超声造影采用CBI造影模式，机械指数（MI）为0.11。　　（3）射频消融治疗系统：RITA1500治疗系统（RITA Medical Systems, Mountain View, CA, USA）和单针电极，电极长10 cm，内径18 G，治疗端长度5 mm（RITA Medical Systems）。　　（4）双通道数显温度表：AZ8856型，台湾衡欣科技股份有限公司。显示温度范围 -200-1760℃。　　（5）微型针式温度传感器：WRT-MI型，广州市圣高测控科技有限公司。测温范围 -50-125℃，直径0.6 mm，长度100 mm。　　2．主要实验试剂：　　脂氟显微泡造影剂，微泡平均粒径2 μm，浓度为4-9×1010／mL。　　3．实验动物：56只健康新西兰大白兔，雌雄不限，3-6月龄，体重1.8-2.5 kg。　　4．实验方法及观察指标：　　实验一：单针电极射频消融兔肝合理参数筛选　　20只新西兰大白兔随机分为四组（n=5），A组（MEUS+RFA-70），B组（MEUS+RFA-80），C组（MEUS+RFA-90）及D组（RFA-80）。A、B、C三组均MEUS治疗后即刻行RFA治疗。D组仅行RFA治疗。MEUS治疗参数：声压4.3 MPa，占空比0.22%，治疗时间5 min。A、B、C、D组RFA目标温度分别设置为70℃，80℃，90℃及 80℃。各组RFA治疗时输出功率为10 W，治疗时间为90 sec。　　20只新西兰大白兔随机分为四组（n=5），A组（MEUS+RFA-70），B组（MEUS+RFA-80），C组（MEUS+RFA-90）及D组（RFA-80）。A、B、C三组均MEUS治疗后即刻行RFA治疗。D组仅行RFA治疗。MEUS治疗参数：声压4.3 MPa，占空比0.22%，治疗时间5 min。A、B、C、D组RFA目标温度分别设置为70℃，80℃，90℃及 80℃。各组RFA治疗时输出功率为10 W，治疗时间为90 sec。　　各组RFA治疗时消融灶中心均进行测温，绘制温度时间曲线。A、B、C三组间各时间点温度实测值两两进行比较，B、D两组各时间点温度实测值进行比较。治疗后24 h观察各组消融灶大体病理表现，比较消融灶最大截面积，对消融灶边缘组织取材观察光镜下相应病理变化。　　观察指标：　　（1）消融灶最大截面积计算公式：(π/4×[Dh×Dv])（注：Dh及Dv分别代表消融灶长径及宽径）　　（2）各时间点消融灶中心实测温度　　实验二：微泡联合低强度治疗超声增强兔肝射频消融的实验研究　　36只新西兰大白兔随机分为两组（n=18），MEUS+RFA组及RFA组。MEUS+RFA组为MEUS治疗后即刻行RFA治疗，RFA组仅行RFA治疗。MEUS治疗参数：声压4.3 MPa，占空比0.22%，治疗时间5 min。两组RFA治疗输出功率为10 W，治疗时间为90 sec，温度设置为80℃。　　应用超声造影技术评价肝脏血流灌注情况。　　治疗后24 h两组分别取13只动物处死，获取肝脏组织，其中10只动物肝脏用于消融灶体积测量，另每组3只动物分别在消融灶与肝组织交界处进行取材，用于光镜观察；紧邻消融灶附近肝组织取材电镜观察。两组剩余5只实验兔分别于术前、术后即刻、术后24 h、48 h、72 h及第8天抽血动态检测血清ALT、AST水平变化。　　观察指标：　　（1）消融体积：装水的量筒称量消融坏死组织。　　（2）超声造影定量分析参数：peak intensity (PI), acceleration time (AT), area under curve （AUC）, ascending slope (AS)。　　（3）肝功能指标：血清ALT及AST水平。　　结果：　　实验一：　　（1）MEUS治疗后即刻，超声造影显示肝实质几乎无增强，仅见粗大血管增强。　　（2）RFA治疗过程中，C组消融灶中心各时间点实测温度最高，B组温度次之， A组温度最低。RFA治疗时，A、B、C三组各时间点（15 sec，30 sec，60 sec，75 sec及90 sec）消融灶中心温度实测值两两比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。　　（3）B组各时间点温度实测值高于D组。二者在各时间点（15 sec，30 sec，60 sec， 75 sec及90 sec）消融灶中心温度实测值差异具有统计学意义（P＜0.05）。　　（4）A组、B组、C组及D组消融灶最大截面积分别为60.0±3.8 mm2，17.3±1.1 mm2，30.0±2.9 mm2及10.9 ± 1.3 mm2。各组间差异具有统计学意义（P＜0.05）。　　（5）大体病理结果，A组消融灶为灰红色，呈弥漫浸润性，消融范围最大。D组、B组及C组消融灶为灰黄色，呈局灶性。C组消融范围大于B组，B组消融范围大于A组，　　（6）A组光镜下以广泛的肝组织退变为主，其内可见散在分布的灶状凝固性坏死区。D组、B组及C组光镜下呈典型凝固性坏死表现，坏死范围广泛。　　实验二：　　（1）MEUS治疗后即刻，超声造影显示肝实质几乎无增强，仅见粗大血管增强。　　（2）对MEUS术前、术后即刻的各超声造影定量参数（PI, AT, AUC, US）分别进行比较，具有统计学差异（均P＜0.001）。　　（3）治疗后24 h，MEUS+RFA组消融体积（4.55±0.83 cm3）约为RFA组（1.63±0.29 cm3）的2-3倍，二者差异具有统计学意义（P＜0.001）。　　（4）MEUS+RFA组及RFA组治疗后早期肝功能均严重损伤，术后24-48小时达到峰值，在8天左右基本上恢复正常。各个时间点二者ALT及AST差异无统计学意义（P＞0.05）。　　（5）光镜下观察，MEUS+RFA组及RFA组消融灶均呈完全凝固性坏死表现，边缘可见炎细胞浸润。MEUS+RFA组坏死灶周围可见肝细胞明显肿胀。　　（6）消融灶周边存活组织电镜下观察，MEUS+RFA组可见肝窦内皮细胞间隙增宽，内皮细胞破裂呈碎片，充满肝窦；肝细胞内可见空泡聚集。RFA组肝窦及肝细胞结构正常。　　结论：　　（1）实验用射频仪器设定消融温度80℃，输出功率10 W，消融时间90 sec是比较理想的参数，既可以使消融组织达到较彻底凝固性坏死的目的，又能客观体现兔肝内实际消融范围。　　（2）对MEUS暂时阻断血流的兔肝进行RFA治疗，其消融体积明显增大。这种联合的治疗方法具有获得完全消融病灶的潜力，从而获得更低的局部复发率和更长的生存时间。