腰椎间盘退变是引起下腰痛的主要原因,被认为是腰椎间盘突出症等疾病的病理基础。腰椎间盘作为一个完整的、相对独立的结构单元,由纤维环、髓核和软骨终板三部分组成,由于生理性及病理性因素的影响,腰椎间盘容易发生退行性变。其中髓核的退变较纤维环和软骨终板更明显,主要表现为水份含量的降低、蛋白多糖含量的下降和胶原成分的改变。髓核内蛋白多糖和水分的丢失可直接影响椎间盘的生物功能,其生物力学特性也随之发生改变,从而引起了一系列的临床症状。国内外对于腰椎间盘退行性疾病的生物学研究取得了一些进展,特别是近年来随着蛋白质组学研究的兴起,对腰椎间盘退变的生化及分子机制的研究也日益深入。目前的研究主要集中在基因遗传学、生物力学和分子生物学等方面,对分子生物学的研究是其中的热点。基因遗传及生物环境是椎间盘退变病因的主要因素,而在椎间盘退变发生过程当中,分子生物因素的影响更为重要。多种细胞因子、酶类和蛋白质均参与椎间盘的退变,他们在椎间盘退变过程中发挥着重要的调控作用。其中包括：基质金属蛋白酶(MMPs)、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、一氧化氮(NO)、转化生长因子-β(TGF-β)、骨形态发生蛋白(BMP)等。MMPs是一类蛋白水解酶家族,在椎间盘退变中起重要作用的主要有胶原酶(MMP-1)和中性蛋白多糖酶(MMP-3)。金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)是近年来发现的能特异性抑制MMPs活性的一组多功能因子家族,研究发现MMPs与TIMPs的动态平衡维持细胞外基质的稳定性,MMPs与TIMPs的失衡是导致细胞外基质过度降解的重要原因。许多细胞因子能对MMPs和TIMPs的活性及表达进行调节。IL-1β和TNF-α可促进金属基质降解酶(MMPs)的产生和分泌,引起软骨基质的降解,并可抑制软骨细胞合成具有透明软骨特性的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原,促进生成有纤维母细胞特性的Ⅰ型胶原,从而使软骨细胞变性、死亡。IL-6可诱导金属基质降解酶抑制剂(TIMP)而不是MMPs本身,通过负反馈作用来抑制酶的破坏。IL-1使椎间盘纤维环细胞产生的前列腺E2 (PGE2)和磷脂酶A2 (PLA-2)增加,且分泌呈剂量依赖性。IL-6能引起软骨基质的蛋白多糖丢失,抑制成纤维细胞的胶原合成。Furusawa证明NO能抑制椎间盘的蛋白多糖合成,用NO合成的竞争抑制剂一氧化氮L-NMA (NG-Methy1-1-argine)不但可以剂量依赖性地抑制NO生成,而且可使椎间盘组织中蛋白多糖的合成增加；反之,用NO合成的促进剂,则蛋白多糖合成降低。有研究发现,退变椎间盘组织TGF-β3的表达下降,TGF-β3可以促进退变椎间盘成纤维细胞Ⅱ型胶原的合成,可以抑制退变晚期椎间盘TGF-β1基因的表达。总体而言,目前对腰椎间盘退变的研究已较深入和广泛,当中涉及到了很多因素及因子,这些因子互相之间形成了一个复杂的网络,它们通过相互作用和协调来调控椎间盘退变,但这些散在的因子之间具体的关联怎样以及是否还有新的因素加入其中还不够清楚。蛋白质作为一种参与构成组织结构、生物信息传递和表达,影响生命活动的大分子物质,在人体各组织和各种疾病及生命活动中发挥着关键的作用。任何一类生命活动几乎都离不开蛋白质的作用,也就造成了蛋白质在不同生命活动状态中的表达存在差异。差异蛋白组学是蛋白质组学研究的主要方向之一,人类重大疾病的蛋白质组研究通常采用比较蛋白质组分析方法。运用比较蛋白质组学研究技术,比较病变组织(细胞)与其起源的正常组织(细胞)或疾病发展不同阶段组织中蛋白质在表达数量、表达水平和修饰状态上的差异,可以发现与病变相关的特异蛋白质,这些疾病相关的特异蛋白质不仅可为研究疾病发病机制提供线索,而且可作为疾病诊断的治疗的生物标志物。比较蛋白质组学技术在肿瘤的发病机制中应用尤其广泛。肿瘤细胞是由正常细胞转变而来,与其起源的正常细胞相比。它不仅含有一些正常细胞所没有的某些特异蛋白质或缺少正常细胞相同的蛋白质,而且也有许多与正常细胞相同的蛋白质,只不过这些蛋白质可能在表达水平或翻译后的修饰加工上与正常细胞存在差别。因此,应用蛋白质组学研究技术比较患同一肿瘤的不同个体的肿瘤组织(细胞)之间或同一个体肿痛细胞与正常起源细胞之间蛋白质在表达数量、表达位置和修饰状态上的差异,可以发现肿瘤相关的特异性蛋白质,这些蛋白质既可作为肿瘤诊断的分子标记,又可作为治疗和药物开发的靶点。而国内外文献还鲜有对腰椎间盘退变总体蛋白差异的研究报道,我们前期通过双向凝胶电泳和质谱分析,对正常和退变腰椎间盘髓核进行差异蛋白研究,发现在正常及退变的椎间盘髓核中存在多种差异蛋白,PeroxiredoxinⅡ(PrxⅡ)为其中的一种。通过对国内外文献检索,我们发现PrxⅡ蛋白是过氧化物酶家族中的一员,广泛的存在于人体的组织器官内,并对生物体内的氧自由基清除、信号转导、细胞增殖及凋亡等方面有着明确的影响,而氧自由基的清除、相关信号转导通路及细胞的增殖和凋亡与腰椎间盘退变的关系密切,由此我们推测PrxⅡ可能通过其相关作用机制在影响着椎间盘退变的发生和发展,但目前国内外文献尚无对PrxⅡ在椎间盘退变中的表达及对腰椎间盘退变作用的相关报道,因此,我们拟对PrxⅡ在腰椎间盘退变中的相关作用进行初步研究,使用蛋白免疫印迹(Western blot)进一步明确PrxⅡ在椎间盘髓核组织中的表达情况,并通过动物模型实验探寻PrxⅡ在腰椎间盘退变过程中的可能作用,为深入研究PrxⅡ蛋白在腰椎间盘退变过程中作用机制及更好的明确腰椎间盘退变的复杂机理提供理论基础。第一章PrxⅡ在腰椎间盘髓核组织中的表达目的：采用Western blot方法明确PrxⅡ在正常及退变椎间盘髓核中的差异表达,为进一步研究PrxⅡ蛋白在腰椎间盘退变中的作用提供基础。材料及方法：(一)、收集2008年3月-2009年4月南方医科大学珠江医院骨科中心突出及脱出腰椎间盘髓核组织手术标本42例,年龄28～65岁,男22例,女20例；其中突出组织26例,脱出组织16例；取材范围L3～L5。所有腰椎间盘退变患者临床表现均有出现1年以上明显的腰腿痛症状,并由MRI证实为腰椎间盘突出或腰椎间盘脱出,术后病理切片证实椎间盘髓核退变；收集正常及新鲜骨折腰椎间盘髓核标本10例,其中男6例,女4例,年龄21-45岁,平均年龄32岁,取材范围L3-L5。(二)、通过Western blot检测所有标本中PrxⅡ的表达,数据分析采用SPSS13.0统计软件,Western blot结果所得结果用(?)±s表示,采用单因素方差分析,组间两两比较采用Dunnett’s T3检验进行分析。结果：1.通过Western blot对正常、突出及脱出髓核组织标本的PrxⅡ蛋白进行检测发现：在22KD附近有明显蛋白表达的条带,PrxⅡ蛋白表达在突出及脱出髓核组织高于正常髓核组织,以β-actin内参对照,经统计学分析发现正常髓核与突出髓核及正常髓核与突出髓核间两两比较差异显著(P<0.001),有统计学意义。2.而PrxⅡ的表达在突出髓核组织低于脱出髓核组织,但差异无显著性(P=0.243),无统计学意义。结论：我们通过Western blot检测PrxⅡ在腰椎间盘髓核组织的表达,发现PrxⅡ在正常髓核组织的表达低于突出及脱出髓核组织,而突出和脱出髓核组织中表达差异不明显。第二章PrxⅡ在兔腰椎间盘退变过程中的作用目的：构建兔腰椎间盘退变模型,通过PrxⅡ对退变模型进行干预,探寻PrxⅡ在兔腰椎间盘退变过程中的作用。方法：将24只新西兰大白兔随机分成高浓度组(n=8)、低浓度组(n=8)和对照组(n=8)。用纤维环穿刺法制作兔腰椎间盘退变模型(L3/4-5/6)。造模成功后,用微量注射器将浓度为1mg/ml、10μg/ml的PrxⅡ分别注入高浓度组和低浓度组L3/4-L5/6椎间盘髓核中,将1%PBS注入对照组椎间盘髓核中,三组注入量均为25μl,在PrxⅡ注射后2、4、12、16周每组各随机选取2只兔,分别采用?方法行蛋白多糖及胶原测定,并行MRI检查了解髓核组织的退变程度。数据分析采用SPSS 13.0统计软件,数据结果计量资料用(?)±s表示,采用析因设计的方差分析及单因素方差分析,组间两两比较采用Bonferroni检验及Dunnett’s T3检验；MRI结果资料采用非参数检验中的Kruskal-Wallis H检验,组间两两比较采用Mann-Whitney U检验。结果：各组髓核组织随着时间的推移退变程度加重,蛋白多糖及胶原蛋白减少,代表水成分的MRI T2信号值逐步下降,病理切片可见细胞数量减少,逐渐为纤维软骨细胞替代。高浓度组的改变较低浓度组和对照组更显著。1.MRI检查结果PrxⅡ蛋白髓核内注射后2、4、12、16周髓核内MRI的T2加权像信号逐步降低趋势(L3/4-L5/6),髓核面积逐渐缩小直至完全消失,椎间隙高度也逐步下降。在第4、12、16周高浓度组髓核MRI的信号较低浓度组、对照组低,两两比较有显著性差异(P<0.05),有统计学意义；而在所有时间点,低浓度组MRI信号较对照组低,但差异不显著(P>0.05),无统计学意义。2.蛋白多糖检测各组髓核内蛋白多糖含量成递减趋势,高浓度组髓核内蛋白多糖含量较低浓度组和对照组减少更显著。蛋白多糖含量在高浓度组(75.75±30.08)最低,对照组(87.88±29.18)最高,两者在第4、12、16周比较差异显著(P<0.01),有统计学意义；低浓度组和对照组比较仅在第16周差异有显著性意义(P=0.02)。3.Ⅱ型胶原蛋白检测结果免疫组化显示Ⅱ型胶原蛋白主要存在于细胞外基质,在正常髓核组织中Ⅱ型胶原蛋白成强阳性染色,面积较大,均匀,分布密度较高,随着时间的延长,Ⅱ型胶原蛋白阳性染色成逐渐减弱趋势,排列不整齐,密度减低。高浓度组(115.13±52.77)与低浓度组(122.51±52.02)在各个时间点比较差异均显著(P<0.01)；低浓度组和对照组(127.22±53.59)仅在第4周比较差异显著(P<0.001),有统计学意义；4.病理结果肉眼观可见正常的髓核组织(L2/3)呈透明胶冻样,量多,无纤维组织样物质；随着时间的推移,髓核组织逐渐混浊,量也逐渐减少,少数可见有血管翳的生长。镜下观可见在正常髓核组织,细胞密度高,分布均匀,随着时间进展,椎间盘的细胞密度逐渐降低,细胞的分布也不均匀,退变组髓核细胞胞质空泡化,出现肥大软骨细胞巨克隆,呈现出软骨细胞的“巢状”结构,以高浓度组改变最为明显。结论：损伤后椎间盘退变是一个逐步加重的过程表现为MRI T2信号减低,髓核面积减小,蛋白多糖及胶原蛋白含量降低,髓核内细胞减少,逐渐为纤维组织所替代。PrxⅡ在椎间盘退变过程中发挥着促进椎间盘退变的作用,且与PrxⅡ蛋白的浓度有关,高浓度(1mg/ml)作用更为明显。