1980年Brown和Admas首次在牛蛙颈上交感神经节中发现了M电流，这是一种慢激活，非失活电压依赖型外向钾离子电流，由于其可被毒蕈碱受体激活后所抑制而得名。M电流在神经系统中广泛存在，是调控神经元兴奋性主要机制。作为唯一在神经元阈电位附近激活的钾电流，其功能降低可以引起神经元兴奋性增高，诱发癫痫等疾病。目前已经发现了众多的神经递质和神经肽均可以调节M电流。　　 G蛋白偶联受体(G protein-coupled-receptors，GPCRs)是目前已经发现的受体中种类最多的一类，具有重要的生理病理学和药理学意义。不同的GPCR通过和相应的G蛋白偶联，在细胞内产生多种生理效应。所有G蛋白都由α、β、γ3个不同的亚单位组成，根据α亚单位可分为4个亚家族：Gs，Gi/o，Gq和G12。　　 在对M电流调节机制的研究中，一个共同的发现就是许多Gq蛋白偶联受体激活后可以引起M电流的抑制。Gq蛋白偶联受体被其特异性激动剂激活后，使G蛋白的Gαq亚基与Gβγ亚基解离，Gαq可以激活PLC，从而水解PIP2，PIP2水解可产生IP3和DAG，IP3通过激动内质网上的IP3受体，升高细胞内钙，DAG可激活PKC。通过多年研究，人们逐渐认识到，细胞膜磷脂PIP2水解、细胞内钙离子浓度升高可能在受体激活抑制M电流中起重要的作用。　　 磷脂酰肌醇4，5二磷酸(phosphatidylinositol4，5-bisphosphate，PIP2)是一种重要的磷脂分子，调控众多细胞过程。在哺乳动物细胞中，PIP2主要来源于磷脂酰肌醇-4-磷酸-5-激酶(Phosphatidylinositol4-phosphate5-kinase，PIP5K)使磷脂酰肌醇4磷酸(phosphatidylinositol4-phosphate，PI4P)肌醇环5位磷酸化这条通路。目前发现的哺乳动物细胞PIP5K可以分为α、β和γ三个亚型。其中γ亚型已发现三种剪切异构体，以所编码的氨基酸数量分别命名为γ635、γ661和γ687。　　 本研究论文以上述转导通路为出发点，利用原代神经元转染、小RNA干扰、激光扫描共聚焦显微镜、蛋白质免疫印记、免疫荧光、细胞内钙成像、电生理膜片钳等技术手段，系统研究了以下几方面内容：(1)大鼠SCG神经元细胞转染方法的建立；(2)大鼠SCG神经元细胞中PIP5K各亚型的表达及亚型特异性PIP5K siRNA的干扰效率；(3)大鼠SCG神经元细胞中PIP5K亚型与PIP2的分布和代谢关系；(4)大鼠SCG神经元细胞中PIP5K亚型与钙信号的相关性；(5)大鼠SCG神经元细胞中PIP5K亚型与M电流调节的关系。研究论文具体内容如下：　　 第一部分大鼠SCG神经元细胞转染方法的建立　　 目的：建立一种高效批量电转染不同年龄SD大鼠SCG神经元细胞的方案。　　 方法：用Nucleofector电转染方法转染7日、14日、40日龄SD大鼠的SCG神经元细胞，然后分别在传统及改良培养液中培养，24小时后用台盼蓝染色方法观察计算细胞转染后成活率；通过改变质粒DNA或小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)与转染液比例，优化转染条件，转染24小时后在共聚焦显微镜下观察计算转染效率或干扰效率。　　 结果：　　 (1)改良培养液可以使14日龄以上SD大鼠SCG神经元转染后成活率达到75％以上，明显高于传统培养液(P＜0.01)，且结果稳定，细胞状态良好，能够满足后续实验的要求；　　 (2)通过优化转染条件显著提高了DNA的转染率及siRNA的干扰率：当DNA与转染液比例为1:100(μg：μ1)时细胞转染率最高；当siRNA与转染液比例为2:100(μg：μ1)时干扰率最高。　　 结论：　　 (1)采用NucleofectorTM转染仪系统，选用G-013转染程序和RatNeuron Nucleofector Kit(货号VPG-1003)，转染SD大鼠SCG细胞效果较好。　　 (2)使用改良培养液使14日龄以上大鼠转染成活率显著提高。　　 (3)实验确定了转染系统中质粒和siRNA最佳浓度，为进一步研究打下了基础。　　 第二部分大鼠SCG神经元PIP5K亚型的鉴定及特异性siRNA干扰效率测定　　 目的：观察大鼠SCG神经元中PIP5K各亚型的分布、表达情况；验证RNAi技术对PIP5K基因的特异性沉默的干扰效率。　　 方法：利用RT-PCR、Western Blot和免疫荧光的方法对PIP5K的α、β和γ三个各亚型在SCG细胞中的表达和分布进行鉴定；利用原代神经元转染和小RNA干扰的方法对PIP5K基因进行特异性沉默，利用WesternBlot方法验证干扰效率。　　 结果：　　 (1)用Western Blot和免疫荧光的方法在7日龄SD大鼠SCG中均未检测出PIP5Kα、β和γ亚型的表达；用Western Blot、RT-PCR和免疫荧光的方法在14日龄SD大鼠SCG中检测到PIP5Kα和γ亚型有表达，α亚型主要存在于细胞膜上，γ亚型则在全细胞均有分布；用WesternBlot方法在14日龄、40日龄SD大鼠SCG中仍未检测出PIP5Kβ亚型的表达，在14日龄、40日龄SD大鼠海马组织中检测到PIP5Kβ亚型的表达。　　 (2)针对PIP5Kα和γ亚型的两种siRNA分别转染SCG细胞，PIP5Kα和γ两种亚型表达受到明显抑制，Western Blot结果和免疫荧光结果均证明PIP5Kα和γ亚型RNAi的干扰效率可达到50％以上。　　 结论：　　 (1)在14日龄SD大鼠SCG中可以检测出PIP5Kα和γ亚型表达，α亚型主要存在于细胞膜上，γ亚型则在全细胞均有分布。　　 (2)特异性的siRNA转染使PIP5Kα和γ两种亚型的表达受到明显抑制，为后续研究奠定了方法学基础。　　 第三部分大鼠SCG神经元细胞中PIP5K亚型与PIP2的分布和代谢关系的研究　　 目的：观察SD大鼠SCG细胞中PIP5K亚型与PIP2分布和含量的关系，观察M受体激活水解的PIP2是否具有PIP5K亚型特异性。　　 方法：利用原代神经元转染和小RNA干扰的技术，观察沉默PIP5Kα、γ不同亚型对大鼠SCG细胞PIP2分布(通过观察与PIP2特异结合的PLC-PH-GFP)、含量（通过观察anti-PIP2免疫荧光）的影响，以及对激活G蛋白偶联受体后水解的PIP2的影响。　　 结果：　　 (1)PIP5Kα亚型基因沉默，对细胞内PIP2的分布和含量影响很大，膜上PIP2富集现象消失；而PIP5Kγ亚型沉默对细胞PIP2分布影响较小，只影响细胞膜PIP2含量，且PIP2减少程度低于PIP5Kα亚型，细胞膜上仍有明显的PIP2富集。　　 (2)沉默PIP5Kα及PIP5Kγ亚型后细胞M受体激活水解PIP2作用被抑制。　　 结论：　　 (1)PIP5Kα亚型基因沉默使细胞膜及细胞浆中的PIP2均明显减少，其中对细胞膜PIP2含量影响最大。　　 (2)PIP5Kγ亚型沉默只对细胞膜上的PIP2含量有较小影响，且PIP2减少程度低于PIP5Kα亚型，但明显影响M受体激活后细胞膜上PIP2的水解。　　 第四部分大鼠SCG神经元细胞中PIP5K亚型与钙信号相关性的研究　　 目的：研究PIP5Kα亚型和γ亚型基因沉默对于SCG细胞内钙信号的影响。　　 方法：利用SD大鼠SCG原代神经元转染和小RNA干扰的技术，分别沉默PIP5Kα亚型和γ亚型基因，通过钙敏感荧光染料Fluo-4/AM检测细胞内钙，激光共聚焦显微镜观察给予缓激肽(BK)时SCG细胞内钙的变化。　　 结果：　　 (1)外液中给予BK时，在转染阴性对照siRNA的SCG细胞中超过68％(34/50)细胞中可以明显看到内钙水平的升高，转染PIP5KαsiRNA的SCG细胞大约为42％(24/55)，而表达PIP5Kγ siRNA的SCG细胞中，只有10％的神经元(5/51)有反应。　　 (2)转染阴性对照siRNA、PIP5Kα亚型siRNA、PIP5Kγ亚型siRNA组对BK有反应的细胞，其内钙浓度与给药前内钙浓度的比值分别为1.76，1.45，1.09，其中PIP5Kγ亚型siRNA组的内钙升高程度与阴性对照siRNA组(P＜0.01)及α亚型siRNA组(P＜0.05)的内钙升高程度相比均显著降低。　　 结论：大鼠SCG神经元细胞中经由PIP5Kγ亚型生成的PIP2的水解是BK受体激活后升高细胞内钙的信号通路。　　 第五部分大鼠SCG神经元细胞中PIP5K亚型与M电流调节关系的研究　　 目的：研究大鼠SCG细胞不同PIP5K亚型在M和BK受体激活后抑制M电流中的作用。　　 方法：利用大鼠SCG原代神经元转染和小RNA干扰的技术，观察分别沉默PIP5Kα和γ亚型基因后，对激活M和BK受体抑制M电流的影响。　　 结果：　　 (1)给予BK后阴性对照siRNA、siRNAα和siRNAγ三组SCG神经元细胞M电流的抑制率分别为79.94±7.67％、97.74±1.52％、57.26±8.03％，siRNAγ组M电流抑制率与阴性对照组相比显著减少(P＜0.05)。　　 (2)给予M受体激动剂Oxo-M后，阴性对照siRNA、siRNAα和siRNAγ三组SCG神经元细胞M电流的抑制率分别为：93.27±3.61％、95.81±4.00％、48.04±4.24％，siRNAγ组M电流抑制率与阴性对照组相比明显减少(P＜0.05)。　　 结论：经由PIP5Kγ亚型合成的PIP2在G蛋白偶联受体激活导致的SCG细胞M电流的抑制中发挥重要作用。　　 总结　　 本研究从PIP2合成的关键酶PIP5K入手，对SD大鼠SCG神经元细胞PIP5K不同亚型在细胞PIP2生成以及其水解后的下游信号结果如内钙释放、M电流抑制等中的作用进行了系列观察。在成功建立了成年SD大鼠SCG神经元细胞最佳转染条件的基础上，鉴定了SCG神经元主要存在PIP5Kα和γ亚型。进一步研究发现PIP5Kγ亚型虽然只生成SCG细胞膜上少量PIP2，但经其生成的PIP2在G蛋白偶联受体激活所致的PIP2水解、细胞内钙释放和M电流抑制中发挥重要作用，而PIP5Kα亚型尽管对SCG细胞中PIP2含量贡献较大，但在上述过程中却发挥较小作用。　　 神经元细胞中PIP5K存在多种亚型，通过生成PIP2而发挥重要的细胞功能调节作用。认识其亚型特异性特征和在细胞信号转导中的意义，对于了解细胞信号转导在离子通道功能调节中的作用及机制有很重要的意义。本研究所建立的实验方法和取得的实验结果，为进一步的研究工作打下了基础和开创了一个新的思路。