鲤春病毒血症病毒诱导细胞凋亡与病毒增殖关系初步研究

来源 :吉林农业大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:liuhu986
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鲤春病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus,SVCV),是鲤春病毒血症(Spring viremia of carp,SVC)的病原。SVC对鲤科鱼类养殖业危害巨大,且其致病机理尚不明确,国际动物卫生组织(OIE)将 SVC 定为必须上报的鱼类疾病之一,我国农业部也将SVC定为一类动物疫病。细胞凋亡是细胞应对多种刺激的一种主动、高度有序的细胞程序性死亡过程,对维持机体内外环境稳定具有重要意义。为了解SVCV的致病机理,本研究对SVCV感染细胞后病毒在细胞内的增殖情况及SVCV诱导细胞凋亡机制进行初步探究。  首先通过对 EPC、CO 两种细胞进行病毒感染,对比 TCID50测定结果,选择最佳敏感细胞进行后续试验;通过建立SVCV-G蛋白标准曲线,利用qRT-PCR方法对SVCV作用敏感细胞不同时间后病毒增殖检测,探究病毒的增殖与细胞病变存在的关系。结果表明:相对于CO细胞,EPC细胞对SVCV更加敏感;qRT-PCR检测,培养8 h后病毒量明显增加,在64 h处达到峰值,与对感染细胞进行形态发生观察时16-32 h细胞开始出现拉网、脱落等明显病变一致。  其次利用Hoechst 33258和透射电镜(TEM)对感染连续培养64 h的细胞进行细胞形态发生观察,初步验证SVCV诱导细胞发生凋亡。通过Annexin V-FITC/PI双染法经流式细胞术对感染不同时间点细胞进行凋亡检测和利用抑制剂对 caspase-3、8、9 表达量进行检测;利用CytoTox 96非放射性细胞毒性检测法,检测感染SVCV的EPC后培养液中LDH的浓度,间接反映出细胞的存活率。结果表明:Hoechst33258染色发现感染SVCV的EPC细胞出现细胞核结构浓染,发出较强荧光的核碎片等现象,透射电镜可见染色质向边缘凝集,并逐步向胞质脱离,最终形成凋亡小体等一系列细胞凋亡典型表征,证实SVCV可以诱导EPC细胞发生凋亡;通过Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡,感染病毒后32-64h凋亡程度显著增加;caspase-3的表达量随病毒作用时间不断增加,到8 h达到峰值,之后逐渐下降。caspase-8的表达量随时间增加,8 h时表达量达到最高,之后表达量不断降低。caspase-9的表达量变化与caspase-3、8的变化规律大体相同,都存在时间依从性,培养到16 h时caspase-9表达量最高;CytoTox 96非放射性细胞毒性检测培养8 h时,对比未感染组LDH浓度明显增加,培养16 h后,尤其是32 h、64 h,感染组的LDH远远高于对照组。  本试验初步探究了SVCV感染后对EPC细胞的影响,验证了该病毒可以诱导EPC细胞发生凋亡,对病毒增殖和细胞凋亡的测定确定了病毒作用细胞的活跃时间段,根据caspase-3、8、9 表达量上调这一发现,推断 SVCV 诱导细胞凋亡存在两种凋亡通路且同时发生。这些试验为SVCV诱导EPC细胞凋亡的机制研究奠定了基础,为进一步对SVCV致病机理的研究提供了方向,为SVC的治疗、用药和防控提供了一定的理论依据。
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