前言冠状动脉弥漫性病变、远端过细、多次手术的病人，因无法通过经皮腔内冠脉成形术(PTCA)、冠脉支架术、冠脉搭桥术(CABG)等再血管化治疗获益，使增加严重缺血或梗死心肌的血供倍受关注。治疗性血管新生已成为一种旁路生物学策略，这对相当数量的弥漫性冠脉病变以及难以接受传统血管重建治疗的患者，可能成为一种新的治疗模式。研究证实在梗死区及非梗死区均存在不同程度的心肌细胞坏死、凋亡，甚至是局部的凋亡，也可导致细胞结构和电活动紊乱，心肌细胞凋亡与心肌梗死后左室晚期重塑和功能不全密切相关。心肌梗死后心肌细胞在数量、性状上存在着不断变化，血管新生、细胞凋亡等对心肌的重塑起重要作用，但其分子生物学机制的研究尚少。一般情况下血管内皮细胞更新率很低，0.25％左右的内皮细胞进入分裂周期，在某些特定的生理和病理情况下，毛细血管及小静脉中的内皮细胞可迅速进入分裂周期，参与血管新生。心肌缺血时，新生血管明显增多，体液因素在其中起了关键的作用。缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)参与体内许多缺氧反应性基因的转录调节，是机体缺氧反应中的关键作用因子，对组织缺血后微循环的重建具有重要意义。它能够与靶基因结合，通过调节转录及转录后的调控，使机体产生对缺氧、缺血的适应反应，HIF-1α的活性增加可减少缺血后的心肌损伤。靶基因作用包括血管内皮生长因子(VEGF)和内皮素-1(ET-1)水平的升高、糖酵解的加强、iNOS活性的增强、ANP的增加等，这些都是HIF-1α对其靶基因作用的结果，因而它们的变化是与HIF-1α密切相关的。其中以血管内皮生长因子(VEGF)最具代表性，VEGF可在不同组织细胞中表达，进而促进血管新生，以保证缺血组织在恢复过程中微循环的建立，药物促进梗死区血管新生已成为研究热点。急性心肌缺血和心肌梗死等心血管疾病存在心肌细胞凋亡，且细胞凋亡参与了心血管疾病的发生与发展，Abbate等认为心肌梗死后，心肌细胞凋亡是梗死后心室重构和心力衰竭发生的一个重要的病理生理机制，与众多基因表达有关，线粒体受损、Bcl-2和Bax平衡状态是缺血性心肌细胞凋亡发生的中心环节。如何减少梗死区以及非梗死区的细胞凋亡，成为改善心肌梗死后存活率及提高生活质量的重要措施。目的人参是一种广泛使用的珍贵药材，可以分离提取出几十种成分，实验发现人参皂苷中的单体成分Rg1、Re等具有血管生长因子样作用，而人参皂苷Rg3却具有抗血管新生的作用，因此对人参皂苷单体成分的研究很必要，为治疗性血管新生能受益于更多没有条件得到上述再血管化治疗的患者，提供了理论基础。本研究旨在了解人参皂苷Rg1对急性心肌梗死(AMI)后血管新生和对VEGF、HIF-1表达的影响及可能机制，探讨人参皂苷Rg1减轻缺血性心肌损伤治疗中的可能性。本实验另通过建立培养心肌细胞的缺氧／复氧模型，观察心肌细胞凋亡率及其相关基因的变化，观察人参皂苷Rg1在缺氧／复氧过程是否有抗凋亡的作用，以探讨Rg1在促进血管新生的同时，保护心肌细胞的作用。实验方法取健康Wistar大鼠104只，建立急性心肌梗死动物模型，对照组和治疗组分别于术后即刻及术后每天腹腔注射生理盐水和人参皂苷Rg1(1mg／kg和5mg／kg)，3d、7d、10d、14d分别取材，每组8只。进行心肌酶学和心肌梗死面积测定、免疫组化法观察梗死区Ⅷ因子阳性血管数和VEGF蛋白表达、RT-PCR法检测VEGF、HIF-1αmRNA的表达。取乳鼠心肌细胞进行原代培养，制备缺氧／复氧模型，MTT法测人参皂苷Rg1对培养心肌细胞活力的影响，并将心肌细胞分为空白对照组、单纯缺氧／复氧组、缺氧／复氧+不同剂量治疗组，荧光双染法观察心肌细胞凋亡的形态学变化、流式细胞术检测细胞凋亡率、RT-PCR法检测bcl-2和bax的mRNA表达。实验结果1．人参皂苷Rg1对心肌酶学的影响假手术组心肌酶明显低于其他各组(P＜0.01)，治疗组与对照组间差异有显著性意义(P＜0.05)，治疗组内部差异无显著意义，提示人参皂苷Rg1有减轻心肌缺血性损伤，保护受损心肌细胞的可能。2．人参皂苷Rg1对心肌梗死面积的影响心肌梗死区先后出现凝固性坏死、炎症细胞浸润、纤维化、瘢痕组织形成等改变，Rg1治疗组梗死面积明显减少(P＜0.05)。3．人参皂苷Rg1对梗死区心肌血管新生的影响光镜下观察发现新生血管靠近心内膜的部位明显多于心外膜，缺血边缘区多于梗死中心区。心肌梗死后梗死区的血管新生数量急速上升，治疗组保持稳定持续的增加，与对照组比较差异有显著性意义(P＜0.01)，不同剂量组间微血管密度也有差异(P＜0.01)。4．人参皂苷Rg1对各组梗死区心肌VEGF表达量的影响心肌梗死后各时段心肌细胞胞浆中VEGF表达较假手术组均明显增加，梗死后3d、7d、10d组VEGF表达逐渐升高，组间比较差异显著(P＜0.01)，治疗组较对照组明显升高(P＜0.01)，第14天增高趋于停止，对照组甚至有所下降。不同剂量组间VEGF的表达也有显著性差异。5．各组大鼠梗死区心肌VEGF、HIF-1αmRNA的表达各组VEGF、HIF-1αmRNA表达均高于假手术组，随时间延长有增高的趋势，治疗组较对照组明显升高(P＜0.01)，14d时VEGF与HIF-1αmRNA表达出现矛盾趋势，即VEGF增长出现停止或下降，而HIF-1α继续升高。不同剂量治疗组间差异有意义(P＜0.05)。6．MTT法测人参皂苷Rg1对培养心肌细胞活力的影响与单纯缺氧／复氧组相比，1.0、2.5、5.0 mg／L人参皂苷Rg1组心肌细胞活力随药物浓度的增加而增加(P＜0.05)，但随着Rg1剂量的继续增加，心肌细胞活力不再增加，而2.5、5.0 mg／L两组间的作用不明显，因此选定1.0、2.5mg／L两种浓度进入下面的实验。7．缺氧／复氧下心肌细胞凋亡的形态学变化在荧光显微镜下观察到AnnexinV-FITC／PI双染后，对照组的凋亡细胞极少；缺氧／复氧后出现不规则细胞碎片，一些细胞呈皱缩状或胞体变小变圆，有的细胞只是细胞膜被染成绿色，为早期凋亡细胞；有的细胞胞核被染成红色，同时胞膜染成绿色，染色质不均匀凝集成块，出现染色质边集、固缩、碎裂，为晚期凋亡或坏死细胞。8．流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率缺氧／复氧组的细胞凋亡率明显大于药物治疗组(P＜0.05)，随着复氧时间的延长细胞凋亡率无明显改变；人参皂苷Rg1处理后，细胞凋亡率降低，在一定浓度范围内有量效关系。9．缺氧／复氧后心肌细胞bcl-2和bax的mRNA表达缺氧／复氧3小时+人参皂苷Rg1处理组(T1、T3组)中发现Bcl-2／Bax比率明显高于单纯缺氧／复氧处理组(D1组)(P＜0.05)，但无明显的量效关系；缺氧／复氧18小时+人参皂苷Rg1处理组(T2、T4组)的Bcl-2／Bax比率较3小时处理组有所下降，但仍高于单纯缺氧／复氧处理18小时组(D2组)(P＜0.05)。结论1．人参皂苷Rg1有降低梗死后心肌酶释放，促进心肌梗死后VEGF、HIF-1α的表达，促进血管新生和缩小心肌梗死面积的作用。2．人参皂苷Rg1有促进培养心肌细胞活力，增加Bcl-2／Bax比率，减少心肌细胞缺氧／复氧后的凋亡。