香蕉为芭蕉科芭蕉属热带果树,世界第一大宗贸易水果。香蕉起源于热带,喜温畏寒。我国栽培香蕉历史悠久,但福建、广西等多个省份为香蕉栽培的北缘地区,经常遭受寒害,低温对香蕉生长生产造成严重危害。福建省野生香蕉资源丰富。为进一步挖掘野生蕉有益基因资源,本研究以三明野生蕉(Musaitinerans)为材料,进行低温胁迫下的全转录组学分析。在野生蕉低温胁迫下的生理生化分析的基础上,利用高通量测序技术,进行野生蕉低温响应的miRNA、mRNA-lncRNA全转录组学分析以及部分miRNAs和IncRNAs与靶基因关系的qPCR验证;克隆了若干抗寒相关基因(CKⅡ家族等)和miRNAs前体,并进行低温胁迫下的表达验证。此外,还对4个抗寒相关重叠基因进行cDNA、gDNA全长克隆鉴定、基因结构与表达分析。本研究旨在探讨野生蕉的低温胁迫响应和抗寒机制,为挖掘利用野生香蕉抗寒基因资源和香蕉的抗寒育种提供科学依据。主要研究结果如下:1.野生蕉低温胁迫过程中的生理生化变化分析对野生蕉组培移栽苗进行28℃、13℃、4℃、0℃(分别为对照、生长临界温度、冷害温度和冻害温度,下同)不同低温胁迫处理,采用分光光度计法测定野生蕉低温胁迫过程中SOD、POD、CAT活性、H202和蔗糖的含量变化。结果表明:野生蕉SOD、POD和CAT在4℃低温胁迫下活性最高,在0℃低温胁迫下有轻微的下调,但比对照(28℃)活性高。这表明低温激活了野生蕉酶类抗氧化系统。同时,野生蕉在4℃低温胁迫过程中H202的含量最高,在0℃胁迫过程中H202的含量有轻微下调,但会高于对照,与抗氧化系统酶活性变化类似。此外,随着温度的降低,野生蕉蔗糖含量显著上升,特别是在4℃低温胁迫下蔗糖含量是对照的1.16倍;在0℃低温胁迫下,蔗糖含量是对照的1.5倍。以上结果表明低温胁迫增加了野生蕉体内H202和蔗糖的含量,有助于提高抗寒能力。2.野生蕉低温响应的miRNAs组学分析采用高通量测序方法,对不同低温(13℃、4℃、0℃,28℃为对照)胁迫下三明野生蕉进行miRNAs测序,并对测序结果进行分析验证。共获得265个known miRNAs成熟体和41个novel miRNAs成熟体。差异表达miRNAs聚类分析结果表明,一些miRNAs会特异响应寒害和冻害胁迫,例如,miR395、miR408、miR172,表明这些miRNAs很可能在野生蕉响应低温胁迫过程中起着重要的作用。miRNAs靶基因的GO和KEGG富集分析结果表明,野生蕉存在多种低温响应途径。而且,miR172可能在野生蕉响应低温胁迫过程中起着核心的协调作用,特别是对CKⅡ和生物钟的调控作用。qPCR验证结果表明,野生蕉响应低温胁迫过程中,差异表达miRNAs与其相应的靶基因呈负调控关系。3.野生蕉低温响应的mRNA-lncRNA组学分析采用高通量测序方法,对不同低温(13℃、4℃、0℃,28℃为对照)胁迫下三明野生蕉进行mRNAs-lncRNAs测序,并对测序结果进行分析验证。转录组差异表达基因KEGG富集分析结果表明,次生代谢、生物钟等一些基础的途径在低温胁迫下高度富集,还有一些途径只在某个特定的组合中富集,这表明野生蕉可能有一些应对低温胁迫的特殊机制。低温胁迫下的可变剪接体(特别是内含子驻留型可变剪接体)的总数量高于对照,表明可变剪接体可能与野生蕉响应低温有紧密的关系。同时,野生蕉响应低温胁迫过程中,共获得12462条lncRNAs。IncRNAs靶基因预测表明,与类黄酮生物合成相关的4类转录因子型靶基因(Zinc finger、MYB、WD40和bHLH)出现的频率位于前列,非转录因子型靶基因富集到前3的途径为水解酶类、蛋白激酶和未知功能蛋白结构域。差异表达IncRNAs靶基因的KEGG富集分析结果表明糖酵解、可变剪接体、碳代谢和生物素代谢途径富集到多数组合中,也有一些途径特异富集到某个温度点。差异表达mRNA和差异表达IncRNAs的比较分析表明,大多数差异表达基因受IncRNAs调控,也说明在野生蕉低温胁迫过程中IncRNAs对差异表达基因的调控起重要的作用。qPCR验证结果表明:野生蕉IncRNAs与其靶基因之间存在复杂的调控关系,既有正调控,也有负调控。在低温胁迫的过程中,一些IncRNAs调控其靶基因,一些lncRNAs只在某个特定的温度下调控其靶基因。4.野生蕉若干抗寒相关miRNAs的前体克隆及分子特性与表达分析在野生蕉miRNA组学数据及分析结果的基础上,挑选差异表达的miR172、miR408、miR395家族成员进行深入分析验证。首先,利用 miRbase(21.0 版)数据库(http://www.mirbase.org/)已登录的植物 miRNAs的前体和成熟体序列信息,采用生物信息学分析方法,对植物miR172、miR408、miR395家族成员进化与分子特性分析。结果表明,物种特异性是影响植物miR172、miR408、miR395前体进化的重要因素,而序列保守性是影响成熟体进化的主要因素。由5p臂上形成的miR172、miR408、miR395成熟体的序列特异性较大,由3p臂上形成的miR172、miR408、miR395成熟体的序列保守较高;茎序列的保守性高于环序列,3p臂上茎序列的保守性高于5p臂上茎序列。其次,在对植物miR172、miR408、miR395家族成员进化与分子特性的基础上,参考野生蕉miRNAs组学测序结果,采用PCR克隆方法,从三明野生蕉叶片中获得miR172c、miR172a、miR408b、miR395a前体序列,长度分别为 497bp、126bp、85bp、81bp。同时,对miR172c、miR172a、miR408b、miR395a的启动子进行分析。研究结果表明:这4个miRNA启动子不仅包括启动子核心元件,还包括光响应、内源激素(ABA、生长素、GI、SA、MeJA和乙烯)、胁迫反应(低温响应、防御与胁迫响应、热胁迫、干旱诱导、机械损伤响应)、生物钟等响应低温胁迫的顺式作用元件。这4个miRNAs启动子都含有数量较多的光响应顺式作用元件,达12-14个。miR395a启动子含有激素响应顺式作用元件种类最多,为5个,其次是miR172c、miR408b、miR172a。含有激素响应元件数量最多的是miR172c,其中MeJA顺式作用元件的数量高达14个。miR172a和miR395a启动子含有生物钟顺式作用元件。miR172c启动子含有低温响应顺式作用元件,miR172a和miR408b含有防御与胁迫响应顺式作用元件。启动子顺式作用元件分析结果说明这些miRNAs可能在野生蕉响应低温胁迫过程中起调控作用。最后,对野生蕉miR172c、miR172a、miR408b、miR395a在不同低温胁迫下(13℃、4℃、0℃,28℃为对照)及不同组织部位(根、假茎和叶片)的表达量进行qPCR验证。结果表明,miR172c、miR172a、miR408b、miR395a都不同程度的参与野生蕉响应低温胁迫,且在不同组织部位特异表达。5.野生蕉CKⅡ基因家族的全基因组鉴定及表达分析野生蕉响应低温胁迫的miRNA组学分析结果可知,差异表达miR172的一个靶基因为CKⅡ,而且在野生蕉响应低温胁迫的mRNA组学结果中CKⅡ也差异表达。因此,我们对野生蕉CKⅡ基因家族进行进一步的成员鉴定以及低温胁迫响应表达分析研究。利用香蕉基因组数据,采用生物信息学分析方法,分析香蕉A基因组(马来西亚小果野蕉,Musa acuminata cv.DH-Pahang,A A group)和香蕉B基因组(PKW 野生蕉,Musa balbisiana cv.Pisang Klutuk Wulang,BB group)CKⅡ基因家族成员,分别获得 13 条和 11 条CKⅡ基因家族成员。保守结构域和聚类分析表明,香蕉A基因组和香蕉B基因组CKⅡ基因家族成员序列差异较大,13条香蕉A基因组CKⅡ基因家族成员都含有CKⅡ完整的STKc_CK2_alpha或CK_Ⅱ_beta功能结构域,11条香蕉B基因组CKⅡ基因家族成员只有3条成员含有CKⅡ完整的STKc_CK2_alpha或CK_Ⅱ_beta保守结构域。由此可知,A基因组CKⅡ基因家族成员的完整性和准确性较大,可作为基础序列为进一步研究CKⅡ基因家族成员提供参考。采用RT-PCR结合RACE技术,参考香蕉基因组序列,从三明野生蕉和福建地方主栽品种天宝蕉(作为比较)叶片中分别获得13条CKⅡ基因家族全部成员完整的CDS序列。其中,三明野生蕉CKⅡβ-like-2含有两条可变剪接体,为外显子缺失型可变剪接现象。三明野生蕉和天宝蕉CKⅡ基因家族成员均含有完整的STKc_CK2_alpha或CK_Ⅱ_beta功能结构域。序列分析显示,三明野生蕉、天宝蕉、香蕉A基因组CKⅡ基因家族成员之间的序列一致性差异较小。相比于B基因组CKⅡ基因家族成员序列,三明野生蕉、天宝蕉CKⅡ基因家族成员和A基因组序列更接近,其中,相比于三明野生蕉CKⅡ基因家族成员序列,天宝蕉和A基因组序列更相似。除了天宝蕉、A基因组的CKⅡβ-like-1成员外,三明野生蕉、天宝蕉和A基因组的β亚基CKⅡ成员都定位于细胞核,而α亚基CKⅡ成员的亚细胞定位情况则各有不同,分别定位于细胞质、线粒体、胞外(包括细胞壁)等。香蕉A基因组、三明野生蕉、天宝蕉CKⅡ基因家族成员的基因结构分析结果表明,α亚基的CKⅡ基因家族成员都为10个外显子、9个内含子型基因结构,β亚基CKⅡ成员都为5个外显子、4个内含子型基因结构,其中三明野生蕉MiCKⅡβ-like-2b和天宝蕉MaCKⅡβ-like-2为4个外显子、3个内含子型基因结构。基因结构决定基因功能,由此可知,α亚基、β亚基CKⅡ成员发挥着不同的功能。磷酸化位点预测分析结果表明,香蕉A基因组、三明野生蕉、天宝蕉发生Ⅱ型酪蛋白激酶的磷酸化位点多发生在β亚基CKⅡ成员上,而α亚基的CKⅡ成员发生Ⅱ型酪蛋白激酶磷酸化的位点较少。香蕉A基因组、三明野生蕉、天宝蕉CKⅡ基因家族成员进行保守基序分析结果表明,CKⅡ基因家族成员中α亚基成员之间、β亚基成员之间的保守基序保守性较高。保守基序较高的保守性更说明了 CKⅡ在真核生物中普遍存在,且结构高度保守的特性。采用荧光定量PCR技术,检测三明野生蕉CKⅡ家族成员在不同低温(13℃、4℃、0℃,28℃为对照)下和不同组织部位(叶片、假茎、根)的定量表达情况。结果表明,CKⅡ-14a、CKⅡ-15、CKⅡ-4在4℃低温下表达量最高,尤其是CKⅡ-14a和CKⅡ-15在4℃下表达量极显著高于对照,而且这三个成员在不同组织部位的表达都是叶片中的表达量高于假茎和根。在0℃低温下表达量最高的有CKⅡ-9和CKⅡ-10两个成员,但差异不显著,较特异的是,CKⅡ-9在根中的表达量显著高于叶片,而CKⅡ-10在假茎和根中的表达量都极显著的低于叶片。在13℃表达量高的成员有CKⅡ-1、CKⅡ-2、CKⅡ-7三个成员,但差异不显著,且都在叶片中表达量最高,在假茎和根中的表达量极显著的低于叶片。CKⅡ-3、CKⅡ-5、CKⅡ-6、CKⅡ-13、CKⅡ-16这5个成员对相对低温或者低温的表达不敏感。三明野生蕉可变剪接体CKⅡ-14b,在不同温度和不同组织部位表达量极低,尤其是在28℃、13℃、0℃、叶片、假茎中的检测不到表达量,在4℃、和根中有及其微量的表达,这与正常转录本三明野生蕉CKⅡ-14a在4℃低温下表达量高的情况正好有较大差异。有意思的是,不耐寒的栽培蕉天宝蕉中唯一一个CKⅡ-14转录本和三明野生蕉CKⅡ-14b成员一样为可变剪接体,不含有CKⅡ-14的正常转录本成员,而香蕉A基因组中的CKⅡ-14成员为正常转录本。这可能是由于物种或进化差异,也可能是三明野生蕉和栽培蕉对低温不同响应程度的体现。6.基于基因组的野生蕉4个抗寒相关重叠基因的分析野生蕉响应低温胁迫的miRNA组学分析结果中,差异表达miRNA172的2个靶基因CKⅡ和ADA1,在低温胁迫过程中可能有重要功能。进一步分析发现,CKⅡ和ADA1在香蕉A基因组第6号染色体上具有特殊的排列方式:CKⅡ(GSMUA__Achr6G 34710,简称710)的3端UTR区域包含一个171 bp具有完整ORF的编码一个小肽的未知功能蛋白基因(GSMUA__Achr6G 34700,简称700);而距离CXⅡ仅1200多bp的甲酰胺酶基因(GSMUA__Achr6G 34720,简称720)和CKⅡ以及700这3个基因“反向”存在于第6号染色体上;甲酰胺酶基因和AZA1(GSMUA_Achr6G 34730,简称730)两个基因之间的距离也仅有2111 bp,且两个基因方向相反,因此两个基因共用一个启动子(即双向启动子)。由这4个基因在染色体上位置的特殊性可知,700和710为同向排列的重叠基因,720和730为反向排列的重叠基因。为了解抗寒的野生蕉中是否也存在4个重叠基因及其特殊的基因排列结构在野生蕉响应低温胁迫过程中是否起作用,我们同时对抗寒的野生蕉和不抗寒的栽培蕉天宝蕉的4个重叠的基因进行鉴定及表达分析研究。参考香蕉A基因组序列,采用TA克隆结合RACE的方法,获得天宝蕉4个重叠基因完整的cDNA、gDNA及启动子序列。天宝蕉重叠基因710启动子、720-730启动子分析发现,两者都含有与低温胁迫相关的顺式作用元件:激素响应、低温响应、生物钟等顺式作用元件。参考阿宽蕉基因组序列,结合天宝蕉重叠基因序列,利用本地blast,分析阿宽蕉重叠基因序列及基因结构。结果发现,在阿宽蕉基因组scaffold1345上,存在4基因的重叠基因序列。阿宽蕉和天宝蕉重叠基因gDNA序列比对分析表明,二者序列保守性较高,730 gDNA序列的一致性最高,达98.96%,700、710、720的序列一致性也都为90%以上。基因间序列的保守性相对较低,序列一致性都在90%以下,710启动子保守性最低,序列一致性为81.05%,双向启动子序列的一致性为87.59%。以28℃为对照,检测野生蕉4个重叠基因在不同低温胁迫下(13℃、4℃、0℃)和不同组织部位(叶片、假茎、根)的表达情况。结果表明,野生蕉700与730的表达趋势相似,而710与720的表达趋势相似。野生蕉响应不同低温胁迫过程中4个重叠基因都起着重要的正调控或负调控作用。此外,重叠基因710与730在不同组织部位的表达模式相似,都为假茎>根>叶;而700与720在不同组织部位的表达模式相反,700的表达模式为根>假茎>叶,720的表达模式为叶>假茎>根。在叶片中表达量最高的为720,在假茎中表达量最高的为710和730,在根中表达量最高的为700,说明野生蕉重叠基因在不同组织部位特异表达。野生蕉在不同低温胁迫过程中4个重叠基因之间均有明显响应,表明4个重叠基因与野生蕉低温响应有关,并在表达趋势上具有一定的相关性。非常有意思的是,730编码的ada1,是植物新近发现的乙酰化复合体组分,与710编码的CKⅡ蛋白,两者均与低温胁迫中低温胁迫响应基因的表达调控密切相关,值得进一步深入研究。总之,本研究在进行野生蕉低温胁迫下的生理生化分析的基础上,利用高通量测序技术进行了野生蕉低温响应的miRNA组学、转录组学和lncRNA组学测序,获得了大量的数据。对挖掘野生蕉抗性基因资源提供了便利,并发现野生蕉响应不同低温胁迫的机制不同,且存在多种低温响应途径,很可能可以作为热带植物响应低温胁迫机制研究的模式物种;同时,基于全转录组学结果进行了若干抗寒相关miRNAs、CKⅡ家族以及4个重叠基因的进一步鉴定与表达分析,为深入探讨野生蕉和香蕉的抗寒机制,提供了新的线索,也为香蕉抗寒育种提供了重要科学依据。