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目的本文探讨BAG-1基因与ER,AKT,ERK,p-AKT,p-ERK的相关性,明确降低BAG-1基因表达水平后乳腺癌细胞对他莫昔芬及AKT抑制剂哌立福新敏感性的变化,观察BAG-1基因在乳腺癌内分泌耐药发生发展机制中及雌激素下游信号转导通路中的调控作用,为乳腺癌内分泌耐药提供新的治疗靶点。方法培养ER阳性乳腺癌细胞株T47D,构建si RNA干扰乳腺癌细胞BAG-1的表达水平,通过实时定量PCR、Western blot等方法验证质粒转染后细胞中ER,AKT,ERK,p-AKT,p-ERK表达水平。给予雌激素受体抑制剂他莫昔芬及AKT抑制剂哌立福新处理,通过MTT法检测乳腺癌细胞生长增殖能力的变化,流式细胞术检测乳腺癌细胞凋亡率及细胞周期情况的变化,观察干扰细胞BAG-1表达对乳腺癌细胞内分泌药物敏感性的影响。结果1.选取乳腺癌细胞株T47D细胞,使用si RNA-BAG-1质粒转染T47D细胞干扰BAG-1表达,通过western blot和real-time PCR检测证实降表达组BAG-1水平表达明显低于空质粒组(P<0.05)。2.Real-time PCR检测发现转染入si RNA-BAG-1的T47D细胞ER表达量较空质粒组显著下降(P<0.05),Western blot进一步验证并发现BAG-1表达水平下降后T47D细胞ER蛋白表达量较空质粒组亦明显下降(P<0.05),同时,p-AKT表达量上升(P<0.05),AKT,ERK,p-ERK蛋白表达均无显著差异。3.分别使用不同浓度的4-OH TAM(1-9u M)和哌立福新(5-25u M)处理si RNA-BAG-1质粒和阴性对照质粒转染后的T47D细胞48h,结果显示与空质粒组相比,降表达组细胞存活率明显增高,其差异随药物浓度增加而增大(P<0.05),而哌立福新处理后降表达组细胞存活率明显降低,差异随药物浓度增加而增大(P<0.05)。4.分别使用4-OH TAM(10u M)和哌立福新(25u M)处理si RNA-BAG-1质粒和阴性对照质粒转染后的T47D细胞48h,流式细胞仪检测细胞凋亡率发现,4-OH TAM处理后,降表达组比空质粒组细胞凋亡率更低(11.0±0.7%vs.20.3±1.0%,P<0.05),哌立福新处理后,降表达组比空质粒组细胞凋亡率更高(7.1±1.3%vs.4.7±0.8%,P<0.05)。对si RNA-BAG-1质粒转染后的细胞进行他莫昔芬单药处理(10u M),哌立福新(25u M)和他莫昔芬(10u M)联合哌立福新(25u M)处理48h,结果显示与哌立福新单药组及他莫昔芬单药组相比,联合用药组细胞凋亡率较高(7.1±1.3%vs 9.4±1.4%vs 11.5±0.9%,P<0.05)。5.使用4-OH TAM(10u M)处理si RNA-BAG-1质粒和阴性对照质粒转染后的T47D细胞48h,流式细胞仪检测细胞周期发现,与空质粒组相比,降表达组分布在G1期的细胞比例减少(67.4±0.8%vs.77.6±1.2%,P<0.05)。对si RNA-BAG-1质粒转染后的细胞进行他莫昔芬单药处理(10u M),哌立福新(25u M)和他莫昔芬(10u M)联合哌立福新(25u M)处理48h,结果显示与哌立福新单药组及他莫昔芬单药组相比,联合用药组细胞分布在G1期的细胞比例增加。联合用药组G1期细胞阻滞率为76.7±1.4%,而哌立福新单药组细胞G1期为61.3±1.3%,他莫昔芬单药组细胞G1期为67.4±0.8%(P<0.05)。结论1.在乳腺癌细胞中,我们观察到BAG-1的表达水平下降后乳腺癌细胞ER的表达水平也降低,提示BAG-1表达水平的变化或可影响ER的表达水平。同时,BAG-1表达水平降低可减弱4-OH TAM对乳腺癌细胞的生长抑制,导致细胞对4-OH TAM敏感性降低。提示我们BAG-1可作为乳腺癌内分泌耐药机制的一个新的研究方向。2.通过基因干扰技术降低BAG-1表达可影响AKT的磷酸化水平。BAG-1的表达水平下降能使细胞AKT磷酸化水平升高,这可能是细胞中ER表达水平下降的原因。他莫昔芬联合哌立福新可部分恢复BAG-1表达水平降低的细胞对他莫昔芬的敏感性,可能原因为BAG-1表达下调后引起ER表达下调和AKT磷酸化增加,从而导致细胞对TAM耐药,AKT抑制剂抑制了AKT磷酸化从而抑制细胞生长。干扰BAG-1表达后影响ER及P-AKT的表达的下游相关通路及其影响他莫昔芬耐药的机制尚需进一步研究。