小鼠卵母细胞发育成熟过程中要经历两个停滞期，分别为GV期（生发泡期）和MⅡ期（第二次减数分裂中期），GV期即处于第一次减数分裂的G2期末，该时期典型的形态学特征是有一个被称为(germinal vesicle，GV)的大细胞核，简称GV期。每个生殖周期，在孕激素的作用下，部分卵母细胞恢复第一次减数分裂，标志是生发泡破裂(GVBD)，伴随着核质的成熟，卵母细胞发育到MⅡ期，成为可受精的卵。如何超越GV期阻滞，启动卵母细胞恢复减数分裂，发生G2/M转变对卵母细胞发育成熟至关重要。但是小鼠卵母细胞G2期阻滞中的机制目前尚未完全研究清楚。14-3-3蛋白是一种高度保守的，大小约28-31 KDa的酸性蛋白家族。哺乳动物至少有七种基因编码14-3-3蛋白亚型，而酵母、果蝇和线虫只有两种基因编码，植物有13种基因编码14-3-3蛋白。哺乳动物14-3-3蛋白种类丰富，是目前研究最多的蛋白质，共包括七个亚型，分别为β，γ，ε，σ，ζ，τ和η，并且各亚型都有特殊的功能。它们通常形成同二聚体或异二聚体发挥作用，功能涉及到细胞周期调控、信号转导、细胞凋亡、细胞生长、肿瘤生长、应激反应、疾病发生等诸多生理、病理过程。14-3-3蛋白通常作为一种“调质蛋白”或“伴侣蛋白”在细胞核与细胞质间来回穿梭，以调节与之结合的靶蛋白的功能。　　 Cdc25蛋白家族是一种双特异性磷酸酶，包括Cdc25A，B，C三种磷酸酶，分别在有丝分裂中发挥重要作用。Cdc25A主要在G1/S期转变时发挥作用，Cdc25B可激活cyclinB-cdc2复合体，导致G2/M期转变，Cdc25C只有在有丝分裂期才有活性，被cyclinB-cdc2高度磷酸化后，形成正反馈环。利用基因敲除技术沉默小鼠Cdc25B基因，由于卵母细胞发生减数分裂阻滞而导致母鼠不孕;而显微注射Cdc25B mRNA却可以恢复减数分裂。这些实验充分说明了Cdc25B对于小鼠卵母细胞的发育是必须的。研究证明Cdc25B蛋白的活性和亚细胞定位由14-3-3蛋白调节。Uchida S等人的研究也证实14-3-3β，ε与人的Cdc25B的309位被磷酸化的丝氨酸结合，驱动Cdc25B定位于细胞质。在G2期阻滞的爪蟾卵母细胞中，14-3-3蛋白与Cdc25蛋白结合在一起，调控卵母细胞的成熟。爪蟾卵母细胞中的研究表明，PKA可直接磷酸化Cdc25的287位丝氨酸，此位点磷酸化后导致14-3-3蛋白的结合，Cdc25活性受抑，卵母细胞发生G2期阻滞。哺乳动物卵在许多方面与爪蟾相似。了解低等动物卵成熟的调节机制，对研究和认识哺乳动物卵母细胞成熟具有重要的借鉴意义。与爪蟾卵母细胞Cdc25-S287的情况相近，在人类细胞系中G2期阻滞也涉及14-3-3蛋白的结合。14-3-3蛋白作为重要的接头蛋白，从酵母到人类，在真核生物G2期阻滞中发挥稳定的保守性作用。那么，小鼠卵母细胞是否存在14-3-3蛋白，它与Cdc25B蛋白在卵母细胞发育中的作用尚不清楚。为了验证14-3-3蛋白在小鼠卵母细胞G2期阻滞中的作用，本研究以小鼠卵母细胞为研究对象，观察14-3-3蛋白和Cdc25B蛋白的表达和亚细胞定位情况，构建14-3-3表达载体，通过过表达和沉默14-3-3蛋白，观察对小鼠卵母细胞在G2/M转变的影响。构建14-3-3荧光表达载体，利用荧光蛋白为标签观察14-3-3与Cdc25B在卵母细胞中的共定位，探讨14-3-3蛋白调控卵母细胞G2/M转变的分子机制，为哺乳动物卵母细胞发育的机理研究提供相关实验依据。　　 材料与方法：　　 一、材料与试剂中国医科大学实验动物部提供昆明系雌性白小鼠;pBSK-Cdc25B由TonyHunter教授(The Salk Institute)惠赠;pEGFP-C3由复旦大学刘喻博士惠赠;克隆载体pGEM-T vector为Promega公司产品;表达载体pcDNA3.1为Invitrogen公司产品; pmax-FP-Red-C为Promega公司产品，E.coli DH5α感受态菌株为购自北京全式金生物技术有限公司;ECL化学发光试剂盒（Piece Biotechnology公司）;预染蛋白Marker、限制性内切酶XhoI、BamHI、XbaI、EcoRI及Pfu DNA Polymerase（MBI公司）;MB培养液、LB培养基（Invitrogen公司）;DNA Marker、Taq酶(Takara公司);mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra kit体外转录试剂盒(Ambion公司);快速微量mRNA提取纯化试剂盒(GE Healthcare公司);protein G-agarosebeads悬液（GE Healthcare公司）;质粒DNA小提取试剂盒（Qiagen公司）;去内毒素质粒中量提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒（Omega公司）;Cdc2-pTyr15磷酸化抗体、Cdc25B一抗(E-19)、β-Actin抗体(Santa Cruz); Western细胞裂解液、Hoechst33258（碧云天生物技术公司）;HRP标记的兔抗山羊IgG、FITC标记的山羊抗兔IgG、HRP标记的山羊抗兔IgG、TRITC标记的兔抗山羊IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）;二丁酰环磷酸腺苷(dbcAMP)、M2和M16培养液（Sigma公司）。　　 二、小鼠卵母细胞的采集和培养3-4周龄的昆明种雌性白小鼠，腹腔注射10 IU孕马血清(PMSG)，48h后颈椎脱臼法处死，剖开腹腔取出卵巢，放于含有125μmol/LdbcAMP的M2培养液中，在体视显徽镜下刺破大的有腔卵泡，获得含完整生发泡的裸卵母细胞，在MB培养液(在Waymouth MB752/Ⅰ培养液的基础上添加100μg/ml丙酮酸钠，50U/ml青霉素，50μg/ml链霉素，3mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，此培养液简称为MB培养液）中，在37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2的培养箱内培养。　　 三、重组载体的构建取小鼠肝组织30mg，用Trizol提取总RNA。设计特异性引物，用RT-PCR扩增，PCR产物经回收纯化，将回收纯化的HA-14-3-3ε克隆到pGEM-T载体上，测序后挑选鉴定正确的阳性克隆与pcDNA3.1-ZEO(+)载体/pmax-FP-Red-C载体同时用EcoRI酶切后连接，构建成pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε和pmax-FP-Red-HA-14-3-3ε融合表达载体，重组载体经测序鉴定基因插入正确。其他构建体pcDNA3.1-MYC-Cdc25B-WT, pcDNA3.1-MYC-Cdc25B-Ser321 A, pcDNA3.1-MYC-Cdc25B-Ser321D, pEGFP-Cdc25B-WT, pEGFP-Cdc25B-Ser321A, pEGFP-Cdc25B-Ser321D为本实验室构建保存。　　 四、体外转录　　 pcDNA3.1-MYC-Cdc25B-WT, pcDNA3.1-MYC-Cdc25B-Ser321 A, pcDNA3.1-MYC-Cdc25B-Ser321D，pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε分别取1μg，经XbaI酶切线性化，应用体外转录试剂盒将线性模板体外转录成带帽mRNA，然后用2U DNaseI于37℃反应15min消化DNA模板，用酚、氯仿抽提纯化mRNA，最后应用氯化锂沉淀mRNA。按需要浓度将mRNA溶于TE缓冲液中，用于显微注射。　　 五、mRNA显微注射显徽注射应用Eppendorf Transferman显微操作系统，OlympusIX-70倒置显微镜，DIC调制相差观察。显微注射在含125μmol/L dbcAMP的M2液滴中进行，为尽量减少显微注射对卵母细胞的影响，一般注入到卵内的样品体积为10p(1)，这相当于卵母细胞体积的5％。mRNA溶解于无核酸酶污染的5mmol/L Tris和0.5mmol/LEDTA(pH7.4)中，稀释成不同浓度。　　 六、质粒胞核显微共注射将GV期卵母细胞移入到M2液滴中，用持卵针将卵细胞固定，将吸好一定量无内毒素的质粒pmax-FP-Red-HA-14-3-3ε注射针刺入细胞将样品注入胞核，在1小时后将无内毒素pcDNA3.1-MYC-Cdc25B-WT或pcDNA3.1-MYC-Cdc25B-S321A或pcDNA3.1-MYC-Cdc25B-S321D的质粒注射针刺入细胞将样品注入胞核，在含500μmol/L dbcAMP的MB培养液中培养。为尽量减少显微注射对受精卵的影响，一般注入到受精卵内的样品体积为10p1（相当于其总体积的5％）。　　 七、Stealth siRNA显微注射14-3-3εStealth siRNA用1ml DEPC处理水稀释，并储存于-20℃。GV期卵母细胞被转移到含180mM dbcAMP的M2液滴中，卵母细胞胞浆被注射5 p1(20μM)的siRNA。显微注射后的卵母细胞被转移到含180mM dbcAMP的MB液滴中，37℃，5％CO2中培养24小时。　　 八、RT-PCR检测GV、GVBD期卵母细胞中14-3-3蛋白七个亚型的mRNA水平100个GV/GVBD期卵母细胞收集到2ml离心管中，按the EllustraTM QuickPrepMicromRNA Purification试剂盒说明书进行:主要包括:样品的提取，mRNA的分离，分别用高盐缓冲液和低盐缓冲液对已结合mRNA的oligo(dT)纤维颗粒的洗涤，mRNA的洗脱。用TaKaRa RNA PCR(AMV)ver3.0试剂盒，按操作步骤进行反转录和 PCR:14-3-3beta(NM_018753.6)的引物∶5’-GAACGTGGTAGGTGCCCGCC-3’和5’-GGCCAGGCTGCAGGCCTTTT-3’，预计产物长度430bp;14-3-3epsilon(NM_009536.4)的引物:5’-GACCGTGCCTGCAGGTTGC-3’和5’-CTTGCCAGTGTGGCCGGAGA-3’;预计产物长度545bp;14-3-3eta(NM_011738.2)的引物:5’-GATATGGCCTCCGCCATGAAGGCG-3’和5’-CATCCTGCTGGTCGCTCGTCCAGAG-3’;预计产物长度655bp;14-3-3tau(NM_008839)的引物:5’-GTCTGACGCGCTCTCTCCTCGCT-3’和5’-GGCGGATTGGATGCGTAGGCTG-3’;预计产物长度420bp;14-3-3gamma(NM_018871.3)的引物:5’-TCCCTCCGACACACGAGCTCCAA-3’和5’-TGGCCACTTCTGCCAGGTAACG-3’;预计产物长度520bp;14-3-3zeta(NM_011740.3)的引物:5’-GTGTCTGCGGAGCGGCTGTAGC-3’和5’-TCTGGTTGCGAAGCATTGG GGA-3’;预计产物长度484bp;14-3-3sigma(NM_018754.2)的引物:5’-CAGTTCGCCCGTCTGTCTGTCCA-3’和5’-GATGGGGTTGGTAGGCGGCATC-3’;预计产物长度538bp;β-actin(NM_007393.3)作为内对照，引物:5’-CGGTCCACACCCGCCACC-3’;和5’-GTCGTCCCAGTTGGTAACAATGCC-3’;预计产物长度269bp; PCR反应体系为25μl，反应条件是①94℃，3min;②94℃，30sec;③50℃，30sec;④72℃，1 min;⑤72℃，10min;②一④循环30-31周。反应产物经琼脂糖凝胶电泳后成像。　　 九、Western印迹收集不同时期的小鼠母卵细胞200枚，转移到1.5 ml Eppendorf管中，4℃离心去除培养液，加入20μl蛋白提取缓冲液，反复冻融裂解，加入SDS样品缓冲液，100℃煮沸5min，12％ SDS-PAGE电泳分离，转膜，用含5％脱脂奶粉的TBST(pH7.4)室温封闭1-2h。封闭后的滤膜与MYC抗体、Cdc2-pTyr15磷酸化抗体、HA抗体、14-3-3epsilon抗体及β-Actin抗体4℃孵育过夜。HRP偶联的兔抗山羊IgG或羊抗兔IgG作为二抗，室温孵育2h。洗膜后，ECL化学发光法显影成像。　　 十、细胞免疫荧光定位将培养到指定时间点的卵细胞，用含0.1％BSA的PBS作为沈液，洗涤3遍，4％多聚甲醛（融解于PBS中）室温固定1小时，或4℃固定过夜，PBST(PBS加0.01％Tween20)洗涤3遍，0.1％ TritonX-100(融解于PBS)打孔30分钟。用封闭液(含5％BSA的PBS)封闭1小时，将卵母细胞转入一抗（抗体用封闭液按1∶800稀释）中4℃过夜，或室温2小时，洗液洗涤3次，每次5分钟，将卵母细胞转入二抗(FITC标记IgG用封闭液按1∶100稀释)中，室温下孵育1小时，沈液洗涤3次，每次5分钟，再用Hoechst33258（10μg/ml溶于PBS中）染色10分钟，使DNA染色。激光共聚焦扫描显微镜观察、照相。　　 14-3-3epsilon与Cdc25B的双染:14-3-3epsilon(一)抗（抗体用封闭液按1∶800稀释）、Cdc25B(一)抗（抗体用封闭液按1∶100稀释）孵育4℃过夜后，洗液沈3次，用FITC标记的山羊抗兔二抗IgG(1∶100)和TRITC标记的兔抗山羊二抗IgG(1∶100)中孵育1小时，洗液洗3次后，用Hoechst33258（10μg/ml溶于PBS中）染色10分钟。最后用激光共聚焦扫描显微镜(400×放大率)照相。每组实验重复三次，每组中至少检测50个卵母细胞。每次实验仪器设置参数相同。　　 十一、MPF活性测定收集不同时期的小鼠卵母细胞，反复冻融3次，使细胞裂解，加入MPF反应液25μl，30℃水浴反应7 min。取25μl点在Whatman P81强阳离子交换滤纸上，以75mmol/L磷酸溶液终止反应后，将滤纸置于含10 ml蒸馏水的液闪瓶内，用Beckman液闪计数仪测定cpm值。　　 十二、细胞培养和转染HEK293细胞用DMEM培养液（添加10％胎牛血清FBS，100U/ml青霉素，10μg/ml链霉素）培养。用fuGENG6转染HEK293细胞。将HEK293细胞分散于100mm的培养皿(2×106细胞/皿，10ml含10％ FBS培养液/皿).在24小时后，细胞共转染5μg pEGFP-Cdc25B(WT、S321A、S321D、vector)和5μgpmax-FP-Red-HA-14-3-3epsilon DNA十三、细胞裂解，免疫沉淀和免疫印迹在转染48小时后，收集细胞，加入预冷的RIPA Buffer(50 mM Tris-HCl，0.25％w/v脱氧胆酸盐，1％NP40，150mM氯化钠，1 mM EDTA，pH7.4，添加蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物）裂解细胞。蛋白酶抑制剂混合物包括5μg/ml亮抑酶肽，胃酶抑素A，抑肽酶，1 mM苯甲基磺酰氟。磷酸酶抑制剂混合物包括1∶100稀释的磷酸酶抑制剂cocktailⅡ(Sigma，USA)，25 mM氟化钠，0.1 mM原钒酸钠和25 mMβ-甘油酸酯。细胞裂解液和鼠单克隆抗HA抗体(Covance)、蛋白G-agarose beads(GE Healthcare)共同孵育。沉淀用裂解缓冲液洗。Western blots分析细胞裂解液和免疫沉淀，鼠单克隆抗HA抗体1∶800(Covance)用于检测外源性表达的14-3-3epsilon，抗-GFP抗体1∶8000(Sigma)用于检测外源性表达的Cdc25B。　　 结果　　 一、GV期小鼠卵母细胞14-3-3蛋白亚型鉴定为了证明GV期小鼠卵母细胞14-3-3蛋白亚型的存在，我们检查了14-3-3七个亚型（β，γ，ε，σ，ζ，τ和η）mRNA水平，结果显示，在GV期只有14-3-3β和14-3-3ε两个亚型存在，而且14-3-3εmRNA水平明显高于14-3-3β mRNA水平。在蛋白水平上，只检测到14-3-3ε亚型的存在，14-3-3ε蛋白在GV、GVBD表达保持恒定，Western blot不能检测到14-3-3β的存在，认为它的表达量是非常低的。　　 二、内源性14-3-3ε和Cdc25B的共定位用间接免疫荧光方法观察内源性14-3-3ε和Cdc25B的定位，结果显示，在GV期，14-3-3ε和Cdc25B共定位于卵母细胞的细胞质。在GVBD前，部分14-3-3ε和Cdc25B进入细胞核。在GVBD后，14-3-3ε和Cdc25B均匀的分布于整个卵母细胞。这个结果说明14-3-3ε和Cdc25B的穿梭伴随着卵母细胞减数分裂的恢复。　　 三、Stealth14-3-3εsiRNA抑制14-3-3ε的表达为了检测Stealth14-3-3εsiRNA是否可以削减内源性的14-3-3ε蛋白水平，在GV期显微注射control siRNA和14-3-3εsiRNA的卵母细胞于MB培养液中进行培养。24小时的培养后，收集卵细胞进行Western Blot和RT-PCR实验。结果显示20μM的14-3-3εsiRNA可以较彻底的抑制的抑制内源性14-3-3ε的表达，而control siRNA注射组则相反。　　 四、敲低14-3-3ε引起部分卵母细胞恢复减数分裂为了敲低14-3-3ε，我们设计了Stealth14-3-3εsiRNA显微注射GV期小鼠卵母细胞，在dbcAMP存在的情况下，在注射后24小时36％的卵母细胞恢复减数分裂，而control siRNA注射组和非注射组并未观测到GVBD的发生。　　 五、Stealth14-3-3εsiRNA对MPF活性的影响和Cdc2-Tyr15磷酸化状态的分析在Stealth14-3-3εsiRNA显微注射后的不同时间点测定MPF的活性，结果显示，MPF的活性在14-3-3εsiRNA显微注射后24小时达到顶峰，而controlsiRNA注射组和非注射组MPF的活性一直保持较低的恒定水平。在14-3-3εsiRNA显微注射后24小时Cdc2-Tyr15是脱磷酸化的，control siRNA注射组和非注射组Cdc2-Tyr15是磷酸化的。　　 六、单独注射14-3-3εmRNA及14-3-3ε mRNA和Cdc25B-WT、Cdc25B-S321A或Cdc25B-S321D mRNA共注射对卵母细胞GVBD率的影响卵母细胞在显微注射后在含有200μM dibutyryl cAMP(dbcAMP)的MB培养基中培养，14-3-3εmRNA and Cdc25B-S321A mRNA共注射组在注射后3小时时卵母细胞的GVBD率是100％(5％ at1h，65％ at2h，and100％ at3h)，在20个小时时有79％的卵母细胞发育到MⅡ。而14-3-3εmRNA单独注射组和其他共注射组都未发生GVBD。　　 七、各种mRNA注射后对MPF活性的影响及Cdc2-Tyr15磷酸化状态的分析在各种mRNA注射后，我们测定了MPF活性，检测了Cdc2-Tyr15的磷酸化状态。14-3-3εmRNA and Cdc25B-Ser321A mRNA共注射组MPF活性在卵母细胞成熟过程中周期性波动，在GV期活性最低，在MⅠ和MⅡ升高，排出第一极体后短暂的降低。而在14-3-3εmRNA单独注射组和其他共注射组MPF活性一直保持较低的水平。14-3-3εmRNA和Cdc25B-Ser321A mRNA共注射组在注射后3个小时，Cdc2-Tyr15是脱磷酸化的，而其他注射组在注射后3个小时Cdc2-Tyr15是磷酸化的。说明过表达14-3-3ε并不影响G2/M的转换。　　 八、14-3-3ε和Cdc25B结合位点的鉴定为了测定14-3-3ε和Cdc25B是否能结合，以及Cdc25B的321位丝氨酸是14-3-3ε和Cdc25B的特异性结合位点， HEK293细胞被转染pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε和pEGFP-Cdc25B-WT或pEGFP-Cdc25B-Ser321A,或pEGFP-Cdc25B-Ser321D或pEGFP-Cdc25B-C3。14-3-3ε用抗HA的琼脂糖珠子免疫沉淀，接下来用抗HA或抗GFP的抗体检测Cdc25B与14-3-3ε的结合。结果显示，野生型Cdc25B能与14-3-3ε结合，然而当Cdc25B的321位丝氨酸突变为丙氨酸时，Cdc25B与14-3-3ε的结合被取消，令人有趣的是，Cdc25B的321位丝氨酸突变为天冬氨酸时，Cdc25B仍然能结合14-3-3ε，说明S321D具有模拟磷酸化的作用。提示14-3-3ε只能与可被磷酸化的S321结合，而不与不能被磷酸化的S321A结合，Cdc25B的321位丝氨酸是14-3-3ε和Cdc25B结合的特异性位点。　　 九、外源性表达的Cdc25B和14-3-3ε的共定位为了检测Cdc25B的321位丝氨酸对Cdc25B和14-3-3ε的亚细胞定位的影响，质粒pEGFP-Cdc25B-WT或pEGFP-Cdc25B-Ser321A或pEGFP-Cdc25B-Ser321D和pRFP-HA-14-3-3ε被共注射到GV期卵母细胞中，注射后卵母细胞被转移到含有500μM dbcAMP的MB培养基中允许蛋白表达。结果显示，红色荧光14-3-3ε与绿色荧光野生型Cdc25B共定位于细胞质，红色荧光14-3-3ε与绿色荧光突变型Cdc25B-S321A主要共定位于卵母细胞的细胞核，红色荧光14-3-3ε与绿色荧光突变型Cdc25B-S321D分布于整个卵母细胞。这个结果进一步证明Cdc25B的321位丝氨酸对14-3-3εand Cdc25B的亚细胞定位的确是关键的。　　 讨论　　 PKA在有丝分裂和减数分裂阻滞中已经被证明是一个关键的调节子。我们以前的研究证实PKA在小鼠卵母细胞减数分裂恢复和一细胞胚胎的发育中通过使Cdc25B的Ser321的磷酸化和脱磷酸化来调节MPF的活性，是MPF的负性调节子。与此同时，我们也证实GV期卵母细胞中S321(Cdc25B)是磷酸化的，GVBD时是脱磷酸化的。最近，我们课题组通过质谱分析证明在体外PKA能磷酸Cdc25B-S321，与Scansite software预测的位点相一致。因此，在哺乳动物细胞Cdc25B是PKA的直接底物。这些资料强烈的建议，在高的cAMP存在下，PKA被激活并且磷酸化Cdc25B的S321。磷酸化的Cdc25B反过来抑制Cdc25B的活性，因此卵母细胞阻滞于G2期。在爪蟾卵母细胞中的研究表明，蛋白激酶A(PKA)磷酸化Cdc25的287位丝氨酸后通过与14-3-3蛋白的结合，影响Cdc25的细胞内定位，抑制其活性，卵母细胞发生G2期阻滞。　　 本研究探索了卵母细胞中是否也存在14-3-3亚型，实验结果显示，在GV、GVBD期14-3-3ε恒定表达，几乎没有变化。由于14-3-3β表达量非常低，WesternBlot不能检测到它的存在。　　 14-3-3蛋白是一个广泛表达的酸性蛋白家族，从酵母到哺乳动物，几乎所有真核细胞都表达，而且在功能和蛋白序列上非常保守。14-3-3结合的靶蛋白包含一个特殊的磷酸化的丝氨酸/苏氨酸结构域能改变他们的催化活性和亚细胞定位。本研究的免疫荧光实验证实了G2阻滞卵母细胞14-3-3ε与Cdc25B共定位于细胞质，而在GVBD前Cdc25B穿梭进入细胞核。非常感兴趣的是随着Cdc25B从细胞质穿梭进入细胞核，部分14-3-3ε也从细胞质进入细胞核。有文献报道，14-3-3在没有结合的配体存在的情况下，从细胞质进入细胞核。大量的证据建议14-3-3蛋白是细胞周期的关键调节子。我们以前的研究证实，在卵母细胞过表达Cdc25B-S321A比过表达Cdc25B-S321D和Cdc25B-WT能更有效的诱导卵母细胞恢复减数分裂。这些结果建议14-3-3可能结合S321并且抑制了Cdc25B的活性，失活的Cdc25B不能激活MPF。这里，我们的发现显示，共表达14-3-3ε和Cdc25B-S321A能诱导卵母细胞发生GVBD，而共表达14-3-3ε和Cdc25B-S321D和Cdc25B-WT却不能诱导GVBD的发生。另外，过表达14-3-3ε并不影响G2/M的转换。这样共表达14-3-3ε抑制了依靠Cdc25B激活MPF活性的能力一定与14-3-3ε结合Cdc25B-WT有关，而Cdc25B-S321A却不受14-3-3ε共表达的影响，仍有能力诱导减数分裂的恢复。这些发现进一步巩固了我们了的结论:14-3-3ε结合到磷酸化的S321(Cdc25B)并且抑制了Cdc25B的激活。积累的证据显示，14-3-3通过结合Cdc25B负调控G2/M的转换，主要是作为脚手架或者是结合后掩盖了特殊的结构域如核定位信号(NLS)或核输出信号(NES)。本实验的14-3-3ε干涉实验显示，下调14-3-3ε的表达能引起部分卵母细胞恢复减数分裂。有报道显示，去除结合于磷酸化Cdc25的14-3-3是G2/M转换的早期步骤，这与我们的报道非常相似。这样，PKA磷酸化S321(Cdc25B)，并且结合14-3-3ε于细胞质，使卵母细胞阻滞于G2期，当敲低14-3-3ε时，Cdc25B激活胞浆中的MPF，从而启动减数分裂的恢复。　　 本研究证实了一个相似的机制，14-3-3ε是通过S321(Cdc25B)来调节Cdc25B的活性的。14-3-3ε能结合野生型Cdc25B，而当Cdc25B-S321突变为Cdc25B-S321A，14-3-3ε与Cdc25B的结合被取消。本研究通过外源表达的14-3-3ε与Cdc25B的定位实验证实，在卵母细胞减数分裂的成熟过程中14-3-3ε决定着Cdc25B的定位。　　 综上所述，我们首次提出在小鼠卵母细胞减数分裂中，PKA/Cdc25B/14-3-3ε通路的可能作用机制，PKA通过Cdc25B的321位丝氨酸的磷酸化修饰，导致14-3-3ε蛋白与Cdc25B结合于细胞质，结合后掩盖了Cdc25B蛋白上的核定位信号，NLS被掩盖后不能介导Cdc25B入核，因此Cdc25B蛋白的出核与入核的动态平衡被破坏，出核速率大于入核速率，细胞核内的Cdc25B含量减少，不能激活MPF，因而发生G2期阻滞。当cAMP水平下降，Cdc25B被一种未知的磷酸酶脱磷酸而激活，接着从细胞质进入细胞核，使Cdc2的Thr14和Tyr15脱磷酸，这样激活MPF，卵母细胞发生GVBD。再后，Cdc25B可能又由细胞核到细胞质。我们的发现进一步解释了14-3-3ε介导的抑制Cdc25B活性使卵母细胞阻滞于G2期。　　 总之，我们的发现不仅证实了鼠卵母细胞PKA/Cdc25B-S321/14-3-3ε途径的作用，而且也提出了一个新的模式，在G2/M转换时，14-3-3ε通过使Cdc25B细胞内再定位来调节它的活性。　　 结论：　　 1、在卵母细胞GV、GVBD期14-3-3ε的表达恒定没有改变。14-3-3ε在卵母细胞的G2阻滞中起着重要的作用。14-3-3ε和Cdc25B能在卵母细胞核中进行穿梭。　　 2、14-3-3ε控制着Cdc25B的细胞质定位。Cdc25B的321位丝氨酸对Cdc25Band14-3-3ε细胞内定位起着关键的决定性作用3、Cdc25B的321位丝氨酸是14-3-3ε和Cdc25B结合的特异性位点，通过结合到这个位点，14-3-3ε控制着Cdc25B的细胞质定位，这样通过Cdc25B和14-3-3ε的结合维持卵母细胞阻滞于G2期。