蛙皮素受体亚型-3(bombesin receptor subtype 3, BRS-3)作为一种新发现的蛙皮素样肽(bombesin-like peptides, BLPs)受体,它与神经介素B受体(the neuromedin B receptor, NMBR)、胃泌素释放肽受体(gastrin-releasing peptide receptor, GRPR)共同组成哺乳动物体内的BLPs受体家族,后两者可分别与NMB、GRP特异性结合发挥重要的生物学功能。对BRS-3的天然配体的研究,国内外至今尚无定论,因而对其基因表达调控方式、生物学功能、生物学意义以及在体内的作用方式、途径所知有限。本课题组对BRS-3进行了一系列的前期研究,发现BRS-3可能参与细胞的生长和损伤修复,并可能参与对呼吸道应激应答反应的调控。用细菌双杂交及免疫共沉淀法还发现了两种新基因编码蛋白,可以与BRS-3发生相互作用,但是其具体的生物学功能及意义不清楚。本课题组将其中一种基因库序列号为NM-152734的新基因编码蛋白命名为蛙皮素受体激活蛋白(bombesin receptor activated protein, BRAP),并对其进行了基因表达调控及生物学功能方面的研究。生物信息学研究结果显示,BRAP可能是一个信号分子。Northern blot显示BRAP在臭氧应激的动物肺组织中表达升高。亚细胞水平的研究发现BRAP在胞膜和胞浆表达丰富,而细胞核内基本不表达,提示BRAP可能作为一种胞浆蛋白,参与应激条件下应激信号的转导和应激条件下某些特定生理功能的调控。人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial cells, HBECs)在应激条件下表现的各种应激应答反应主要包括：细胞增殖和修复、表达粘附分子、与基质粘附或白细胞粘附、摄取处理抗原并将相应的抗原信息呈递给淋巴细胞激活免疫应答反应。BRAP对HBECs增殖和损伤修复的影响前期已经完成,发现BRAP高表达后可以上调HBECs的增殖和损伤修复速度。因此,本课题将主要研究BRAP高表达或沉默后对HBECs抗原呈递功能的影响,探讨BRAP是否可以通过影响HBECs的抗原呈递功能从而影响HBECs对炎症等应激的反应,以及BRAP在气道高反应中可能的作用机制。目的：通过研究BRAP在臭氧应激小鼠肺组织中的定位和表达,为BRAP是否在气道上皮细胞应激反应中发挥作用提供信息。然后构建BRAP高表达稳定细胞系、筛选BRAP有效沉默质粒并瞬时转染HBECs,研究在BRAP不同表达水平下,HBECs对外源性抗原的摄取能力、HBECs细胞表面MHC-Ⅱ类分子HLA-DR及共刺激分子B7家族中各分子的表达量、HBECs对与之共培养的人外周血淋巴细胞的增殖和分化的影响。通过以上三个方面研究,对BRAP在HBECs应激应答反应中的影响及BRAP在气道高反应中可能的作用机制进行初步探讨。方法：(1)Real-time PCR法及免疫组织化学法分别从mRNA水平和蛋白水平检测BRAP在臭氧应激肺组织中的表达和定位。(2)构建pcDNA3.1(+)/BRAP重组质粒和pcDNA3.1(+)空载体质粒,分别转染HBECs,用G418筛选稳定转染细胞系。筛选BRAP的有效沉默质粒和阴性对照质粒,瞬时转染进HBECs中。采用Real-time PCR法及Western blot法分别从mRNA水平和蛋白水平检测各组HBECs中BRAP的表达情况,鉴定BRAP高表达稳定细胞系是否构建成功,并鉴定BRAP沉默质粒的沉默效率。(3)以FITC-OVA作为一种外源性的抗原,用荧光显微镜或流式细胞术跟踪观察孵育30 min、60 min、90 min后,pcDNA3.1(+)/BRAP高表达HBECs、pcDNA3.1(+)空载体HBECs、正常HBECs三组HBECs对FITC-OVA的摄取情况,以阳性细胞百分率或者细胞内平均荧光强度表示FITC-OVA的量,反映BRAP不同表达水平对HBECs摄取外源性抗原能力的影响。(4)采用Real-time PCR和流式细胞术检测BRAP表达水平不同的各组HBECs中HLA-DR和B7家族各分子的表达量,反映BRAP不同表达水平对HBECs表达MHC-Ⅱ类分子及共刺激分子的影响。(5)将pcDNA3.1(+)/BRAP高表达组、pcDNA3.1(+)空载体组、BRAP沉默组和阴性对照组HBECs接种6孔板,用1 mg/ml的OVA预处理2h后,与新鲜分离的人外周血淋巴细胞共培养48h,分别收集淋巴细胞和细胞培养上清液,用流式细胞术检测淋巴细胞周期,MTT法测淋巴细胞增殖,ELISA法检测上清液中IFN-γ、IL-4、IL-17的含量,反映BRAP不同表达水平对淋巴细胞增殖和分化的影响。结果：(1)与正常对照组(臭氧攻击0天)相比,臭氧攻击2天、4天的昆明小鼠肺组织中BRAP mRNA水平及蛋白水平均明显升高,BRAP参与支气管肺组织的应激应答反应。(2)与稳定转染pcDNA3.1(+)空载体质粒的HBECs(?)目比,稳定转染pcDNA3.1(+)/BRAP重组质粒的HBECs中BRAP mRNA水平及蛋白水平均显著性升高,BRAP过表达稳定细胞系构建成功；与转染阴性对照质粒组HBECs相比,转染干扰质粒的HBECs中BRAP mRNA水平及蛋白水平均明显降低,BRAP干扰质粒可有效沉默BRAP的表达,可用于后续试验。(3)pcDNA3.1(+)/BRAP高表达HBECs、pcDNA3.1(+)空载体HBECs、正常HBECs三组HBECs对FITC-OVA的摄取能力均随孵育时间的延长而增加,90min达高峰。与相同时间点的pcDNA3.1(+)空载体组HBECs及正常对照组HBECs相比,pcDNA3.1(+)/BRAP高表达组HBECs对外源性抗原的摄取能力明显下降,BRAP高表达抑制HBECs的抗原摄取能力。(4)与pcDNA3.1(+)空载体组HBECs相比,pcDNA3.1(+)/BRAP高表达上调HBECs中HLA-DR及B7家族各分子的mRNA表达水平,并上调HLA-DR、B7DC的蛋白表达水平,但下调CD86、B7-H1蛋白的表达；而与阴性对照组HBECs相比,BRAP沉默上调HBECs细胞表面CD86的表达。(5)与pcDNA3.1(+)空载体组HBECs相比,pcDNA3.1(+)/BRAP高表达组HBECs抑制与之共培养的人外周血淋巴细胞的增殖,下调淋巴细胞周期中S期细胞百分比,上调G1期细胞百分比；而与阴性对照组HBECs相比,BRAP沉默组HBECs上调淋巴细胞周期中S期细胞百分比,下调G1期细胞百分比。(6)与pcDNA3.1(+)空载体组HBECs相比,pcDNA3.1(+)/BRAP高表达抑制淋巴细胞分泌IL-4和IL-17,但对IFN-γ的分泌无明显影响。而BRAP沉默对淋巴细胞分泌细胞因子无明显影响,还需加大样本量。结论：(1)臭氧攻击促进小鼠支气管肺组织中BRAP的表达,提示BRAP可能参与调控支气管肺组织对臭氧攻击等应激应答的反应并参与应激信号的传递。(2)BRAP过表达抑制HBECs对外源性抗原的摄取,通过对MHC-Ⅱ类分子及共刺激分子表达的调控,抑制HBECs的抗原呈递能力,进而抑制淋巴细胞的增殖与分化。