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热休克蛋白(heat shock protein,HSP)是植物体内最重要的一类逆境诱导蛋白,它们在逆境条件,尤其是温度胁迫下迅速合成,使细胞免受损害。HSP具有分子伴侣功能,参与各种各样的细胞代谢过程,它们还与植物抗热、抗冷以及抗氧化性密切相关。因此,热激基因是育种工作中具有重要实用价值的优良基因资源。刺山柑(Capparis spinosa)作为干旱区特有植物,具有极强的干旱适应性,它抗旱、耐高温、耐风蚀、耐瘠薄,其生存的基本环境,总是与干旱背景中比较原始的荒漠土壤相联系,这些特点使刺山柑成为育种工作中不可多得的优良抗逆基因的供体,对刺山柑的抗逆基因资源进行开发和利用具有重要的实践意义。
RNA提取是基因工程研究当中的重要环节,RNA质量的优劣是基因克隆成败的关键,通过实验,我们确立了一种最合适的提取刺山柑叶片总RNA的改良SDS法,该方法具有成本低、时间短、获得的RNA产量高、质量好等特点。
利用RT-PCR结合cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)方法,我们成功的从刺山柑叶片中分离了HSP基因家族的一个HSP70基因(CsHSP70)和一个sHSP基因(CsSHSP),并在Genebank上注册,登录号分别为EU574936和EU574935。CsHSP70基因全长2202bp,ORF共1950bp,编码649个氨基酸,表达产物分子量为71.0446kD,序列分析表明该基因属于HSP70基因家族。CsSHSP基因全长917bp,ORF共678bp编码225个氨基酸,表达产物分子量为25.119kD,序列分析表明该基因属于叶绿体sHSP基因家族。
我们构建了CsHSP70和CsSHSP基因的原核表达载体,并使重组质粒PGEX-4T-2-CsHSP70和PGEX-4T-2-CsSHSP在大肠杆菌中异源表达,通过细胞温度胁迫实验证明,它们异源表达可提高大肠杆菌耐高温(50℃)和低温(4℃)的能力。