铅是一种广泛存在于环境,严重危害人类健康的重金属元素。在工业化迅猛发展的今天,在我们的日常生活中铅可谓无处不在,溶混在大气、土壤、尘埃、水、日用品、装饰材料、玩具、学习用品中,甚至在食品、中药材中也有它们的身影。铅对神经、造血、消化、泌尿、生殖和发育、心血管、内分泌、免疫、骨骼等各类器官均有不良影响。低水平铅暴露(≤100g/L)即能干扰血红素的合成,引起肠道铁离子吸收障碍,产生缺铁性贫血。更为严重的是它影响婴幼儿和儿童发育的中枢神经系统,从而造成智力、记忆力、神经行为的障碍。铅容易通过胎盘和血脑屏障,胎儿脑对血铅易感。铅可通过脐带或母乳垂直传播。研究发现,铅可直接作用于人体的海马和大脑皮层,导致认知缺陷和智力下降。慢性低水平的铅暴露不但影响儿童的智力发育,还影响学习行为和听觉等多方面的神经系统发育过程,其影响是长远和严重的。有关铅的神经毒性作用的研究很多,但至今对其神经毒作用的分子机制仍不清楚。已有研究表明,NF-κB在胞内信号转导过程和基因表达调控中具有重要的作用,而目前有关铅对中枢神经系统NF-κB信号转导通路影响的研究未见报道。本实验拟从分子水平上探讨NF-κB信号转导通路与铅的神经毒作用的关系。研究PC12细胞在低剂量铅暴露情况下,其核转录因子NF-κB、p53基因及Bcl-2基因的变化,并探讨这种变化与铅的神经毒性的内在联系。本研究分两部分,研究内容及结果如下:第一部分醋酸铅对PC12细胞NF-κB转录活性的影响目的:探讨醋酸铅及NF-κB抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)对核转录因子-kappa B(NF-κB)转录活性的影响。方法:将大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞)暴露于不同浓度的醋酸铅0μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L、1600μmol/L,采用四唑盐比色实验(MTT )检测IC50值。用脂质体将pNF-κB -Luc报告基因质粒转染入PC12细胞,转染后的PC12细胞分别暴露于不同浓度的醋酸铅(100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L)及不同浓度醋酸铅加PDTC100μmol/L, 24小时后采用萤光素酶(Luciferase)检测试剂盒检测萤光素酶活性。结果:用不同浓度的醋酸铅处理细胞24小时,其生长增殖受到不同程度的抑制,且呈现出剂量反应关系,其IC50值为(533.966±100.830)μmol/L。用不同浓度的醋酸铅处理转染后的PC12细胞24小时,结果显示:PDTC对照组萤光素酶活性较空白对照组降低(P<0.01);铅处理组萤光素酶活性较空白对照组高(P<0.01),且具有剂量依赖性;铅+PDTC联合作用组与PDTC对照组相比,PC12细胞内萤光素酶活性增高(P<0.01);结论:醋酸铅可诱导PC12细胞的NF-κB转录活性升高。第二部分NF-κB, p53及Bcl-2在铅诱导PC12细胞凋亡中的作用研究目的:近年来许多研究发现p53、Bcl-2基因在细胞凋亡的调控过程中起着重要作用。本实验试图从基因表达和蛋白质表达水平上进行观察,从分子水平上探讨铅诱导PC12细胞凋亡的分子机理。方法:应用逆转录-聚合酶链反应检测p53、p65 mRNA的转录;用免疫印记的方法检测铅对Bcl-2蛋白的表达;用流式细胞术研究醋酸铅诱导PC12细胞凋亡情况及其分子机理。结果: PC12细胞经不同浓度醋酸铅(100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L)处理24小时后,用流式细胞仪检测其凋亡率(n=3),铅组凋亡率明显高于对照组,改变呈剂量依赖性。差异有显著性(P< 0.05)。RT–PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,在404bp(β-actin)、493bp(p65)和538bp(p53)处均出现特异性扩增条带。采用凝胶图像分析系统分别对电泳条带进行密度分析。结果显示p65 mRNA、p53 mRNA转录水平随铅剂量升高而升高(p<0.05),两基因表达的改变呈剂量依赖性。Western Blot结果显示,表明随着铅浓度的增加,Bcl-2蛋白表达逐渐降低。结论: PC12细胞暴露于铅后,其凋亡率升高,诱导凋亡的这种效应可能与增强NF-κB及p53基因的活性、降低Bcl-2基因的活性有关。