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目的:原发性肝细胞癌是全球第六大常见癌症,死亡率位居癌症相关死亡第四位。由于其肝内及远处转移高发,患者预后不容乐观,因此早发现、早治疗是改善肝癌患者预后的关键因素。进一步探究肝癌侵袭、转移和复发的分子机制,以寻求新的早期生物标志物或治疗靶点,对改善患者预后至关重要。Bit1是一种失巢凋亡效应分子,参与多种肿瘤发生发展,可能成为肿瘤的诊断标志物或治疗靶点。已有的研究发现Bit1表达情况呈肿瘤特异性,且影响肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等,从而在不同肿瘤中发挥促癌或抑癌两种截然相反的作用。目前为止,尚无Bit1与肝癌关系的相关研究。本研究旨在探究Bit1在肝癌组织中的表达情况及临床意义,阐释Bit1在肝癌中的生物学功能及作用机制,揭示西妥昔单抗通过干预Bit1从而阻碍Bit1高表达肝癌进展的分子机制,为探索以Bit1为靶点的肝癌相关研究提供新的思路和依据,为Bit1高表达肝癌患者提供以西妥昔单抗为主的个体化联合用药治疗方案,拓展西妥昔单抗在癌症治疗领域的适应症。方法:1.通过RT-qPCR、Western blot、组织芯片免疫组化技术、生物信息学技术探究Bit1在肝癌组织中的表达情况、临床意义和Bit1相关信号通路及可能存在相互关联的分子。2.通过Western blot筛选Bit1内源性高表达的肝癌细胞系,构建Bit1 shRNA的干扰质粒和慢病毒载体,通过慢病毒转染实验干预肝癌细胞内源性Bit1表达;通过细胞划痕实验、Transwell实验分析不同Bit1表达水平对肝癌细胞迁移、侵袭能力的影响;CCK-8细胞增殖实验、流式细胞术、TUNEL实验分析不同Bit1表达水平对肝癌细胞增殖、凋亡的影响;透射电镜观察不同Bit1表达水平对肝癌细胞线粒体形态结构的影响,从而阐释Bit1在肝癌细胞中的生物学功能。3.通过Western blot、细胞免疫荧光法检测不同Bit1表达水平肝癌细胞中ZO-1、N-cadherin、Vimentin、PCNA、Ki67、Bax、Bcl-2蛋白表达,揭示肝癌中Bit1与EMT及增殖、凋亡相关分子的关系。4.根据生物信息学分析结果提示肝癌组织中Bit1与EGFR可能存在一定关联,进一步选用EGFR抑制剂西妥昔单抗干预肝癌细胞,用CCK-8法进行药物细胞毒性试验,根据药物IC50值确定合适给药浓度范围,根据预实验结果选择药物最佳干预时间,用西妥昔单抗干预Bit1、EGFR均高表达的肝癌细胞LM3,抑制肝癌细胞EGFR,Western blot检测Bit1表达水平,明确肝癌中Bit1与EGFR的关系;检测integrinβ1、MMP-2、MMP-9表达情况,明确肝癌中Bit1与细胞外基质受体相关通路中的关键分子之间的关系;检测ZO-1、E-cadherin、Vimentin等EMT标志分子及PCNA、Bax、Bcl-2蛋白表达情况,分析比较西妥昔单抗通过干预Bit1表达水平对肝癌细胞EMT进程及增殖、凋亡相关分子的影响。结果:1.Bit1在肝癌组织中的表达情况及临床意义检测Bit1在肝癌组织中的m RNA及蛋白表达水平,结果显示:Bit1在肝癌组织中的表达水平显著高于对应癌旁组织。其中Western blot显示:肝癌组织中Bit1蛋白水平与肿瘤组织病理分级呈正相关;组织芯片免疫组化技术显示:Bit1在肝癌组织中的表达水平与HCC患者的肿瘤病理分级与复发密切相关,且与HCC患者术后生存期呈负相关;生物信息学分析结果显示:PTRH2在肝癌中高表达,且PTRH2表达与HCC患者肿瘤分期呈正相关,与HCC患者总生存期呈负相关,且与HCC患者术后发生转移性复发密切相关,String数据库分析发现PTRH2可能与CDH1,CDH2,VIM,TJP1等编码EMT相关蛋白的基因可能存在一定关联,并与EGFR存在一定关联,KEGG通路数据库分析发现PTRH2与细胞外基质受体等相关通路呈负相关,与核糖体等通路呈正相关。2.Bit1表达水平对肝癌细胞生物学功能的影响Western blot筛选出Bit1高表达的肝癌细胞系MHCC-97H、LM3进行Bit1shRNA慢病毒转染实验,下调其细胞内源性Bit1表达,分析不同Bit1表达水平对肝癌细胞生物学功能的影响。细胞划痕实验检测24 h、48 h划痕愈合率,其中,24 h愈合率分别为:WT=39.4%,Vector=40.2%,Bit1 shRNA1=19.4%,Bit1shRNA2=16.5%,48 h愈合率分别为:WT=60.9%,Vector=60.9%,Bit1 shRNA1=27.5%,Bit1 shRNA2=18.5%,说明Bit1下调可明显抑制肝癌细胞迁移能力;Transwell实验检测48 h后侵袭到小室下表面的细胞数量,发现Bit1下调可明显抑制肝癌细胞侵袭能力;CCK-8实验检测72 h内的细胞活力,结果表明Bit1下调可显著抑制肝癌细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡情况,各组细胞总凋亡率分别为WT=4.21%,Vector=7.45%,Bit1 shRNA1=11.75%,Bit1 shRNA1=19.31%,表明Bit1下调可明显促进肝癌细胞凋亡能力;TUNEL实验结果证实Bit1下调可显著增加肝癌细胞晚期凋亡数量,与流式细胞术实验结果一致;电镜结果显示:Bit1下调可导致肝癌细胞线粒体肿胀,嵴轻度扩张、断裂等损伤。3.Bit1在肝癌中的作用机制Western blot、细胞免疫荧光法检测发现,Bit1下调后,ZO-1、Bax蛋白表达上调,而N-cadherin、Vimentin、PCNA、Ki67、Bcl-2蛋白表达下调,推测Bit1下调可通过抑制EMT进程及调控增殖、凋亡相关分子而抑制肝癌进展。4.西妥昔单抗通过调控EGFR/integrinβ1/Bit1轴抑制EMT进程阻碍Bit1高表达肝癌进展生物信息学分析结果提示肝癌中Bit1可能与EGFR存在一定关联,且Bit1表达与ECM受体相关通路呈显著负相关,因此,我们进一步探究肝癌中Bit1与EGFR、细胞外基质受体相关通路中关键分子之间的关系。选择EGFR靶向抑制剂西妥昔单抗作为干预药物,用CCK-8法进行细胞毒性试验,根据西妥昔单抗IC50值确定药物作用浓度分别为200、600、1800μg/m L,根据预实验结果选择西妥昔单抗最佳干预时间为72 h,干预同时高表达Bit1、EGFR的肝癌细胞LM3。结果显示,西妥昔单抗可明显下调LM3细胞EGFR、Bit1、MMP-2、MMP-9、Vimentin、PCNA、Bcl-2蛋白表达,而显著上调integrinβ1、E-cadherin、ZO-1、Bax表达,其对EMT标志蛋白及增殖、凋亡分子的影响与Bit1下调后实验结果相一致,从而推断西妥昔单抗可通过调控EGFR/integrinβ1/Bit1轴抑制EMT进程而阻碍Bit1高表达肝癌进展。结论:1.Bit1在肝癌组织中高表达,并与患者预后不良密切相关。2.Bit1下调可明显抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭,促进肝癌细胞凋亡,并破坏肝癌细胞线粒体形态结构。3.Bit1下调可通过抑制EMT进程,调控增殖、凋亡相关分子抑制肝癌进展。4.西妥昔单抗通过调控EGFR/integrinβ1/Bit1轴抑制EMT进程而阻碍Bit1高表达肝癌进展。