论文部分内容阅读
腈水合酶（nitrile hydratase,简称NHase,EC 4.2.1.84）是一种存在于原核和真核生物中的金属酶,可催化腈类化合物合成相应的酰胺类产物,而酰胺类物质作为重要的化工原料和有机合成中间体,在大宗化学品生产及医药领域有着广泛的应用。目前,NHase在丙烯酰胺的工业生产上已逐渐取代传统化学法,但生产过程中依然存在一些问题,尤以热稳定性问题最为突出。因此,获取新型耐热型NHase对于提升NHase工业化水平意义重大。随着基因组测序技术的发展,基因库（Gene Bank）中被注释但尚未解析的NHase基因数量迅速增多,挖掘具有优良热稳定性的新型NHase基因,将在一定程度上可缓解目前丙烯酰胺工业生产中NHase所面临的热稳定性不足的问题。本研究通过基因挖掘手段,在基因库中获取了温泉热碱芽孢杆菌Caldalkalibacillus thermarum TA2.A1来源的耐热型NHase（Cal.t NHase）基因,并利用E.coli BL21（DE3）宿主对目的基因进行异源表达,分析所挖掘Cal.t NHase的酶学性质,通过蛋白质工程手段探究潜在影响NHase热稳定性的关键氨基酸位点,具体研究内容如下:（1）Cal.t NHase的基因挖掘与异源表达。在基因库中挖掘潜在的耐热型NHase基因,通过筛选最终选择来源于温泉热碱芽孢杆菌Cal.thermarum TA2.A1的NHase（Cal.t NHase）基因,经密码子优化、基因合成后构建表达载体pET-24a（+）-Cal.t NHase,采用E.coli BL21（DE3）宿主进行异源表达,通过优化重组表达菌株的诱导条件,在0.1 g·L-1 Co2+,0.2 mM IPTG可实现Cal.t NHase过量表达。在Cal.t NHase的β亚基C端添加strep-tag标签,成功获得电泳纯目的蛋白。（2）Cal.t NHase的酶学性质表征通过高效液相色谱测得Cal.t NHase催化烟腈的比酶活为395 U·mg-1。采用凝胶过滤分子排阻测定Cal.t NHase的聚集形式,发现Cal.t NHase以α2β2异源四聚体为主。该酶在60℃下处理7 h残余酶活为57.5%,70℃的半衰期约为14 min。对Cal.t NHase的底物及产物耐受性进行分析,发现该酶在1 M烟腈处理30 min可保留52.9%的酶活,在2 M烟酰胺处理30 min残余酶活为53.3%。在全细胞催化生产烟酰胺过程中采取分批补料全细胞催化,通过对补料浓度及补料间隔时间进行优化,最终选定以0.4 M的烟腈粉末在催化前期每隔6 min添加一次,最终催化生成烟酰胺的浓度为495 g·L-1,比相关文献报道以异源表达来源于红球菌Rhodococcus rhodochrous J1的高分子量H-NHase催化生成烟酰胺的产量高26.9%。（3）基于半理性设计的Cal.t NHase热稳定性改造通过比较Cal.t NHase及来源于嗜热假诺卡氏菌Pseudonocardia thermophila JCM3095的NHase（Pt NHase）β亚基各氨基酸的RMSF值（Root mean square fluctuation,均方根偏差）,定位到Cal.t NHase的β亚基第150位的组氨酸（βHis150）对其热稳定性至关重要,通过构建βHis150饱和突变体,发现当βHis150突变为任何一种其他氨基酸时,其热稳定性急剧下降。通过对野生酶及突变酶Cal.t NHase-H150S进行凝胶过滤分子排阻研究聚体存在形式,发现突变酶Cal.t NHase-H150S在适当加热过程中β亚基不稳定,β亚基会出现断裂及变性。经分子动力学模拟,发现βHis150位于多聚体两个β亚基交界面,且该位点与另一β亚基的第203的Trp形成的氢键相互作用,具有稳定蛋白的功能。根据在Cal.t NHase中βHis150在该NHase热稳定性中起到关键作用,将应用于工业生产的红球菌R.rhodochrous J1来源的H-NHase的β亚基相对应的150位点（βAsn154）突变为His,其热稳定性升高,比酶活也提高了50.0%,进一步提高了该酶工业应用价值。