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目的:
通过体内实验和体外实验探讨汉防己甲素(Tet)对人胃癌BGC-823细胞凋亡的影响,并对其作用机制进行初步研究,为汉防己甲素临床应用提供理论基础和实验依据。
方法:
取对数生长期的人胃癌BGC-823细胞株,在含10%胎牛血清的DMEM培养液中培养。采用不同浓度的Tet分别处理BGC-823细胞24,48和72h后,以MTT法检测细胞增殖抑制率并计算出Tet对BGC-823细胞的半数抑制浓度(IC50),作为实验参照浓度。采用流式细胞法检测不同浓度Tet作用后,胃癌BGC-823细胞的凋亡率;采用蛋白印迹技术(Western blotting),细胞免疫荧光染色和实时荧光定量PCR检测不同浓度Tet作用后凋亡相关蛋白和mRNA的表达;体外建立胃癌裸鼠荷瘤模型,用不同浓度Tet处理后,免疫组织化学染色检测凋亡相关蛋白的表达。
结果:
(1) Tet能抑制人胃癌BGC-823细胞增殖,2-10μ g/ml的Tet作用24h后对细胞的生长抑制率分别是17.08%、37.85%、49.52%、58.02%、71.31%;作用48h后其抑制率分别是22.84%、53.74%、64.60%、82.34%、89.22%;作用72h后其抑制率分别是39.56%、69.87%、86.71%、95.12%、98.06%。在2-10μ g/ml浓度范围内与对照组相比较,差异具有显著性(P<0.05)。用Tet处理BGC-823细胞24,48和72h后,IC50分别为6.1,4.5和3.7μ g/ml。
(2)流式细胞术结果显示,人胃癌BGC-823细胞经过不同浓度Tet处理后,凋亡率明显增高,呈浓度-时间依赖性。6,8和10μ g/mlTet作用24h后,与对照组相比,处理组细胞凋亡率增加,统计学有显著性差异(P<0.05)。8μ g/mlTet分别作用12,24和48h后,处理组细胞凋亡率与对照组相比较,统计学有显著性差异(P<0.05)。
(3)人胃癌BGC-823细胞分别经过6,8和10μ g/mlTet处理后,根据Western blotting结果,与对照组相比,实验组Bax,Bad和Bak蛋白表达增加,Bcl-2和Bcl-xl蛋白表达降低(P<0.05),根据实时荧光定量PCR结果,与对照组相比,bcl-2和bcl-xl mRNA表达水平降低,bax mRNA表达水平增加,呈浓度依赖性(P<0.05)。BGC-823细胞经8μ g/mlTet分别处理0,12,24,48和72h后,Bcl-2蛋白表达水平降低,Bax蛋白表达水平增加,呈时间依赖性(P<0.05)。根据免疫荧光染色结果,BGC-823细胞经过8μ g/mlTet处理24h后,Bcl-xl蛋白表达水平降低,Bax蛋白表达水平增加(P<0.05)。
(4)人胃癌BGC-823细胞分别经过6,8andl0μ g/mlTet处理后,与对照组相比,处理组caspase-3和caspase-9表达增加,用caspase抑制剂z-VAD-fmk(10μmol/L)预处理4h后,用Tet8μg/ml处理24h,z-VAD-fmk能抑制Tet引起的活性的增加(P<0.05)。
(5)建立人胃癌BGC-823细胞株的裸鼠荷瘤模型,用药后观察裸鼠一般情况,对照组无明显异常,高剂量组裸鼠随治疗进行逐渐出现精神萎靡、摄食摄水减少等表现。进一步观察移植瘤体积变化,对照组裸鼠瘤体体积明显高于汉防己甲素干预组(低剂量组和高剂量组),统计学有显著性差异(P<0.05)。
(6)胃癌裸鼠荷瘤组织的免疫组织化学染色结果显示:Bcl-2,Bcl-xl表达增加,Bax,Caspase-3,Caspase-9表达降低,统计学有显著性差异(P<0.05)。
结论:
汉防己甲素能显著抑制人胃癌BGC-823细胞株的增殖,并且可能通过活化线粒体信号传导途径诱导其凋亡。