恒河猴凝血功能及部分基因分子遗传比较研究

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目的:恒河猴是凝血药物和同种、异种移植临床前研究中最重要的动物模型,为了探索和评价新的凝血药物的作用效果,提供猪到猴异种移植后凝血紊乱的病因机制和防治策略,预测猪到人的异种移植的可能凝血结果,我们初步研究了恒河猴的凝血系统。 方法:采用TEG检测恒河猴的凝血和纤溶功能的整体概况;采用凝集试验测定PT、APTT,一期法测定CFⅡ、CFⅦ、CFX的活性,底物显色法测定ATⅢ的活性;全自动血细胞仪计数PLT;RT-PCR法检测恒河猴、猪和人肝组织CFⅡ、CFⅦ、CFX和ATⅢ mRNA的表达并使用Totallab 2.0软件定量分析;以上数据结果采用SPSS 12.0统计学软件分析并比较猴、人和猪之间的差异:使用λZAP Express为载体构建恒河猴肝脏cDNA表达文库,用PCR法进行文库筛选,结合RACE技术获得恒河猴CFⅡ、CFⅦ、CFX和 ATⅢ全长cDNA序列,利用生物信息学方法推测其氨基酸序列,并与人、猪进行比较。用SWISS-MODEL程序模拟创建凝血酶原蛋白的三维结构并比较其在重要的大分子相互作用位点上与人、猪凝血酶原的差异。 结果:TEG 检测显示猴的凝血功能比人的强、纤溶功能却较人的弱(P<0.05);猴的PT比人的长(P<0.05),APTT则短于猪而长于人(P<0.05)。猴的CFⅡ、CFⅦ活性较猪和人的强(P<0.05),而CFX、ATⅢ活性较猪和人的弱(P<0.05);猴的PLT数量较人的高(P<0.05);猴肝CFⅡ、CFX、ATⅢ的mRNA表达量较猪的低(P<0.05),CFⅦ的mRNA表达量较人和猪的低(P<0.05);首次获得了恒河猴四个凝血相关基因的全长cDNA序列。猴与人、猪四个凝血基因比较均显示了差异,差异最大和最小的分别为CFⅦ和 ATⅢ。凝血酶原cDNA全长序列推导出的蛋白质序列含有1个信号肽、1个前导肽、1个Gla结构域、2个Kringle结构域和1个Trypsin结构域。恒河候凝血酶原基因与人、猪的比较发现,在一些重要结合位点上存在差异。 结论:以上结果显示了猴与人、猴与猪在凝血方面存在着一定的差异,尽管他们之间的高度相似性为猴作为动物模型的可行性提供了依据,而他们之间的差异(包括结构和功能上的差异)更应该引起我们的注意:因为这些差异可以严重影响凝血药物的临床应用真实性(偏离于临床前研究),影响由猪到猴的移植结果预测猪到人异种移植结果的可信度。
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