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目的: 1、观察涤痰散结活血软坚法中药对NAFLD大鼠模型的影响,包括大鼠的体重、解剖外观、肝湿重、肝指数等。 2、测定涤痰散结活血软坚法中药对NAFLD大鼠模型指标性的影响,包括大鼠血清ALT、AST、GGT、GLU、TC、TG等,并利用 ELISA方法测定大鼠血清 IL-6、SOD浓度的变化,对肝脏进行组织病理学观察,以指标化的方式验证涤痰散结活血软坚法中药对NAFLD的确切疗效,以指导临床。 方法: 雄性SPF级Wistar大鼠60只,体重为188±10g,正常喂养1周以适应环境,1周后,将大鼠按体重层次随机分为4组:正常对照组14只,自由饮水和普通饲料饮食;模型对照组18只,中药高剂量组14只,中药低剂量组14只,均予自由饮水和高脂饲料饮食(84%基础饲料,4%蛋黄粉,10%猪油,2%胆固醇),分别用黑色油笔于鼠尾部标记编号1-60号,利于随后观察对照,每周称重一次,8周后随机处死模型对照组大鼠4只,确定脂肪肝模型成立。 造模成功后,分别对低剂量组和高剂量组以1.28g生药/100 g体重/日和2.56g生药/100g体重/日行中药灌胃,模型对照组、正常对照组以生理盐水灌胃,每天晨起一次灌胃,持续8周。 在灌胃8周后实验结束,隔夜禁食,第二天早上先称体重,后以10%水合氯醛0.33ml/100 g剂量腹腔注射麻醉大鼠,固定大鼠,剖开腹腔,游离筋膜,暴露腹主动脉,采用釆血真空管腹主动脉取血法(取血约6-10ml),釆血真空管的血样4℃下静置2小时后,3000转/分离心15分钟,分离血清,分别装在标记号码的EP管,部分随即进行ALT、AST、GGT、TG、TC、GLU等生化检测,部分随即存于-20℃冰箱以备 ELISA测IL-6、SOD值。用无菌镊子和剪刀将整个肝脏完整分离出来,电子天平称取肝湿重,选新鲜肝脏最大叶取小块肝组织马上浸泡于10%中性甲醛固定液中固定,用作石蜡切片,以病理组织学检测,整个过程在冰盘上操作。 以上化验及检测结果,采用SPSS19.0软件进行最后数据的统计,计量资料采用平均值(x)±标准差(s)的方式表示。多组间比较采用单因素ANOVA,首先对数据进行正态性检验,然后进行方差齐性检验,方差齐则用 LSD法进行两两比较,如果数据方差不齐,则采用Welch法进行方差分析,应用DunnettT3法进行两两比较。等级资料采用秩和检验。所检测结果P<0.05被认为有显著性差异,P<0.01被认为有非常显著的统计学意义,而P>0.05被认为是无统计学意义。 结果: 实验1、涤痰散结活血软坚法中药对NAFLD大鼠肝功、血脂、血糖及血清 IL-6、SOD影响的实验研究 1、大鼠血清ALT、AS T比较,高剂量组、低剂量组与模型对照组比较有非常显著性差异(P<0.01,P<0.01),高剂量组与低剂量组比较无统计学意义(P>0.05)。血清GGT比较,高剂量组与模型对照组比较,P<0.05,统计学有显著性差异,而低剂量组与模型对照组比较,P>0.05,无统计学意义。 2、大鼠血清TC、TG比较,高剂量组与模型对照组比较均有非常显著性差异(P<0.01,P<0.01),低剂量组与模型对照组比较均有显著性差异(P<0.05,P<0.05),高剂量组与低剂量组比较均有显著性差异(P<0.05,P<0.05)。 3、大鼠空腹血糖比较,高剂量组与模型对照组比较有非常显著性差异(P<0.01),低剂量组与模型对照组比较有显著性差异(P<0.05),而高剂量组与低剂量组比较有显著性差异(P<0.05)。 4、大鼠血清IL-6浓度比较,高剂量组、低剂量组与模型对照组比较均有非常显著性差异(P<0.01,P<0.01),高剂量组与低剂量组比较有显著性差异(P<0.05)。 5、大鼠血清SOD比较,高剂量组与模型对照组比较有非常显著性差异(P<0.01),低剂量组与模型对照组比较有显著性差异(P<0.05),高剂量组与低剂量组比较无统计学意义(P>0.05)。 实验2、涤痰散结活血软坚法对NAFLD大鼠肝组织病理学影响的实验研究 1、剖开大鼠腹腔,肉眼所见,模型对照组大鼠腹腔肥大,脂肪组织丰富,肝脏体积增大明显,色泽呈黄色或泛白色,肝脏包膜紧张,切面油腻,呈典型脂肪肝外观。高剂量组、低剂量组较模型对照组腹腔脂肪组织有不同程度减少,肝脏体积减小,色泽呈暗红色或偏黄色,一部分大鼠肝脏切面有油腻感,高剂量组肝脏外观较正常对照组比较接近。 2、涤痰散结活血软坚法中药高剂量组、低剂量组大鼠肝湿重均明显低于模型对照组(P<0.01,P<0.01),差异有非常显著统计学意义,高、低剂量组肝湿重比较P>0.05,没有统计学意义。复方中药高剂量组、低剂量组大鼠肝指数均明显低于模型对照组(P<0.01,P<0.01),差异有非常显著统计学意义,高、低剂量组肝指数比较P>0.05,没有统计学意义。 3、各组肝组织病理学所见,模型对照组:肝组织结构不清晰,肝小叶结构尚存。肝细胞弥漫水变性,部分气球样变。肝实质内可见肝细胞多灶状坏死,重度弥漫性脂肪变性(占肝细胞50-75%),并见肝细胞再生及增生。部分肝界板破坏,可见碎屑样坏死。汇管区扩大,纤维组织增生,长入肝小叶内,并见纤维间隔形成,伴中等慢性炎细胞浸润。高剂量组:肝组织结构尚清晰,肝小叶结构存在。肝细胞轻—中度水变性。肝实质内偶见肝细胞点灶状坏死,肝细胞散在轻—中度脂肪变性(占肝细胞5-30%),并见肝细胞再生。局灶性肝界板可见轻度碎屑样坏死。部分汇管区轻度扩大,纤维组织轻度增生,偶见少量慢性炎细胞浸润。低剂量组:肝组织结构欠清晰,肝小叶结构尚存。肝细胞中度水变性,小灶性气球样变性。肝实质内可见肝细胞点灶状坏死,肝细胞中度脂肪变性(占肝细胞30-50%),并见肝细胞再生及增生。局灶性肝界板可见碎屑样坏死。汇管区扩大,纤维组织增生,长入肝小叶内,部分伴少量慢性炎细胞浸润。正常对照组:肝组织结构完整、清晰,肝小叶结构正常,肝细胞及肝血窦沿中央静脉呈放射状整齐排列。肝细胞呈多角形,细胞大小一致,核圆形,位于细胞中央,染色质较稀疏,核膜清楚,偶见肝细胞增生。汇管区无扩大,未见纤维组织增生及炎细胞浸润。 结论: 1、涤痰散结活血软坚法中药能显著降低NAFLD大鼠血清ALT、AST、GGT,改善肝功能,疗效确切,但疗效没有表现出剂量相关性。 2、涤痰散结活血软坚法中药可以明显降低血TC、TG,纠正血脂紊乱,减少肝细胞脂肪沉积,同时可以显著降低空腹血糖,且以上作用表现出剂量相关性趋势。 3、利用ELISA测定浓度,涤痰散结活血软坚法中药可以显著减低血清IL-6浓度,减轻炎性反应,减少其诱导的细胞凋亡和胰岛素抵抗,保护肝细胞,且此作用表现出剂量相关性趋势。中药可以明显升高血清SOD浓度,可以减少不稳定的超氧化离子等的产生,减轻肝细胞氧化应激反应,但此作用没有体现出剂量相关性趋势。 4、涤痰散结活血软坚法中药可以减少大鼠腹腔脂肪堆积,降低肝湿重和肝指数,减少脂肪在肝脏的沉积,可以明显改善肝组织病理学所见,减轻肝细胞的脂肪变。