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骨骼肌卫星细胞亦称为肌肉干细胞,是位于骨骼肌细胞膜和基膜之间具有增殖、分化潜力的肌源性干细胞,其增殖与分化程度对骨骼肌纤维的数量起决定性作用,决定了出生后动物肌肉的产量。
力生长因子(Mechano Growth Factor, MGF)又称机械生长因子,是胰岛素样生长因子(IGF-1)的选择性剪接体之一。当啮齿类动物机体受到机械力刺激或者组织损伤时,IGF-1基因最先剪接成MGF基因,即在外显子5的区域插入52bp碱基(人类插入49bp),引起基因的开放阅读框移位,从而导致DNA序列结构和功能的特异性。研究表明,MGF基因可以激活鼠骨骼肌卫星细胞,促进细胞增殖以及抑制其分化,还刺激骨骼肌的肥大,促进损伤肌肉的修复。
MGF基因在人或鼠骨骼肌卫星细胞的增殖、分化过程中发挥了至关重要的作用,主要应用在人体医学研究肌肉损伤修复方面,而关于MGF在猪生长、发育方面的研究尚未见报道。本研究以为研究对象,采用MTT和细胞计数法确定最适的MGF添加浓度,应用流式细胞仪检测细胞的周期分布与增殖情况,明确添加MGF对猪骨骼肌卫星细胞增殖、分化的作用,同时通过在基因、蛋白水平上检测肌卫星细胞增殖、分化过程的标志基因MyoD、MyoG和MEF-2A基因的表达,探讨MGF作用的分子机理。所得主要结果如下:
1.成功分离、纯化和鉴定了猪原代骨骼肌卫星细胞。
2.建立了稳定的猪骨骼肌卫星细胞冷冻、复苏培养方案。
3.确定1.5ng/mLMGF对猪骨骼肌卫星细胞的促增殖作用最明显,为最适添加浓度。
4.在24h内,MGF可以促进更多猪骨骼肌卫星细胞进入细胞周期。在3h,MGF+组MyoD基因的相对表达量极显著低于对照组(P<0.01);在15h和24h,MGF+组中MyoD基因的相对表达量显著低于对照组(P<0.05);在3h、15h和24hMGF+组MyoD蛋白的表达水平均低于对照组,而Myogenin、MEF-2A基因的相对表达量都很低,几乎检测不到。说明在24h内,MGF+很可能通过下调MyoD基因及蛋白的表达水平,以维持猪骨骼肌卫星细胞处于细胞分裂旺盛期,阻止细胞进入生肌分化阶段。
5.MGF使猪骨骼肌卫星细胞推迟2天进入生肌分化阶段。在第7天,MGF+组骨骼肌卫星细胞Myogenin、MEF-2A基因的相对表达量均极显著低于对照组(P<0.01);其蛋白水平的表达均与基因水平一致。MGF很可能是通过某种机制下调促分化基因Myogenin和MEF-2A及其相应蛋白的表达,从而推迟分化。到第10天,MGF+组猪骨骼肌卫星细胞中MyoD基因的相对表达量显著高于对照组(P<0.05),而MEF-2A基因的相对表达量显著低于对照组(P<0.05);MyoD、MEF-2A蛋白的表达分别与其基因水平的结果相一致;与对照组相比,MGF+组中Myogenin基因、蛋白的表达均很低,几乎检测不到。此时,MGF+组猪骨骼肌卫星细胞开始形成肌管,其MyoD基因表达的上调,可以促使部分细胞进入分化期,而大部分细胞仍然处于分裂增殖阶段,促分化因子Myogenin基因还未充分地表达,所以由Myogenin基因激活的MEF-2A基因的相对表达量显著低于对照组。