苝醌类色素液态发酵及其分离纯化的研究

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竹红菌素等苝醌类化合物是一种潜在的优良光敏剂,可以作为新一代的光动力抗肿瘤药物。竹黄子座含有多种苝醌类化合物,但其数量有限,无法满足大规模应用的需求,因此通过微生物发酵的方法获得苝醌类色素是目前研究的趋势。论文以从野生竹黄子座中筛选到的一株无性竹黄菌作为材料,分别研究了利用HPLC法和分光光度法检测发酵液中苝醌类化合物检测方法的优化、液态发酵培养基组成及培养条件的优化、发酵液中色素的提取及分离纯化工艺的确定。主要结论如下:1)建立了提取液中色素种类以及单一色素含量测定的高效液相检测方法,该方法采用汉邦科技有限公司的天玑C18柱(5.0μm,4.6 mm 250 mm),流动相为60%乙腈,流速1.0 mL/min,柱子温度为25℃。在37.72 - 754.40 mg/L范围内,痂囊腔菌素样品浓度与峰面积呈极显著正相关;在14 - 219 mg/L范围内,竹红菌甲素(HA)样品浓度与峰面积呈极显著正相关。发酵液中色素总量的测定采用分光光度计法,以痂囊腔菌素作为标准物质,波长为460 nm,此时吸光值与样品浓度呈极显著正相关。2)通过单因素实验和响应面实验设计确定了无性竹黄菌液态发酵培养基的组成:土豆200 g/ L,葡萄糖60.95 g/L,蛋白胨12.0 g/L,硫酸镁0.80 g/L和NaCl 5.0 g/L,在此培养基上进行培养,色素产量为2.07 0.20 g/L;培养条件:pH 8.0,装液量50 mL/250 mL,接种量7%,温度30℃,摇床转速200 r/min,种子培养时间42 h,发酵周期3天。培养条件优化后,色素产量达到2.795 g/L,产量比优化前基础培养基提高了3倍多。3)建立了液态发酵液中苝醌类色素的提取及分离纯化工艺:(a)发酵液的提取工艺:提取剂为90%乙醇,发酵液与90%乙醇体积比1:7,提取温度为室温,提取时间为2.0 h,提取次数为2次。(b)浓缩液的萃取工艺:萃取剂为二氯甲烷,料液与二氯甲烷体积比为5:2,萃取温度为室温,萃取次数2次,每次萃取时间为24 h。(c)柱层析工艺:柱子填料为100~200目聚酰胺,流动相为45%甲醇,流速为3.5 mL/min,柱子温度为20℃,柱子规格为1.5 cm 20 cm。(d)半制备高效液相工艺:使用汉邦科技有限公司天玑C18柱(10μm,3 cm 25 cm),流动相为60%乙腈,流速为35 mL/min,柱子温度为25℃。通过以上纯化步骤,痂囊腔菌素C的纯度达到98%以上,竹红菌甲素的纯度达到90%以上,色素的总收率为76.7%。
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