甘油氧化酶高产菌株的筛选、酶的分离纯化及酶学性质研究

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甘油氧化酶(Glycerol Oxidase,GLOX)在氧气存在的情况下,可将甘油氧化为甘油醛,同时产生过氧化氢。甘油氧化酶可以替代甘油激酶和甘油磷酸氧化酶对血液中的甘油三酯进行测定。甘油氧化酶还可将乙二醇经由羟乙醛氧化为乙二醛,可将乙醇酸氧化为乙醛酸。因为酶催化反应的速度快,无副产品产生,如将其用于工业生产乙二醛和乙醛酸,具有广泛的应用前景。   日本曲霉(Aspergillus japonicus)是半知菌纲的丝状真菌,是产生甘油氧化酶的重要菌种。为了提高甘油氧化酶的产量,本研究首先利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导T-DNA转化真菌引起插入突变的原理,构建了日本曲霉突变体文库,对该文库中的332株日本曲霉转化子进行甘油氧化酶产量检测,筛选到4株产量提高的转化子,其中Ajyz0079较初始菌株As5999甘油氧化酶产量提高了50%,摇瓶条件下Ajyz0079甘油氧化酶活力达到10.02U。   对日本曲霉生产甘油氧化酶的摇瓶和10L罐体发酵条件进行研究。确定日本曲霉生产甘油氧化酶的摇瓶发酵条件为:107个日本曲霉孢子接入已灭菌的装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中,30℃、180r/min发酵培养24h;10L罐体发酵条件为:109个孢子接种到灭菌后装有8L发酵培养基的10L发酵罐中,30℃,风量450L/h,灌压0.03-0.04Mp,搅拌转速200r/min,发酵18h。   通过收集菌体,液氮研磨,硫酸铵沉淀,Sephadex G-25凝胶色谱柱脱盐,HiTrap Q HP离子交换层析和琼葡糖G-200 FF凝胶过滤层析对甘油氧化酶进行了分离纯化,纯化后甘油氧化酶蛋白纯度达98.98%,比活达到38U/mg。经SDS-PAGE确定甘油氧化酶单体分子量为66kDa,推测其由六个分子量为66kDa的亚基组成。   甘油氧化酶在以甘油为底物时,最适作用温度为37℃,温度对酶活力影响较大,随温度升高酶活力逐渐降低;最适pH为7.0,在pH9.0-9.5范围内稳定;1mmol/L的Cu2+和Co2+对甘油氧化酶活力的促进作用较明显,10mmol/L的Ca2+、Co2+、A13+和Mn2+对甘油氧化酶活力的抑制作用较明显;其Km值为14.34mmol/L,Vmax为5.93×10-4mmol/L.min-1。
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