甜瓜果面沟调控基因Cmsf1的精细定位及甜瓜再生体系种质筛选

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甜瓜果面沟是甜瓜果实外观品质的重要组成部分。通过精细定位并克隆甜瓜果面沟调控基因,对进一步探究其分子机理及开发分子标记进行辅助育种具有重要意义。本研究以无果面沟的甜瓜自交系‘Y101’和有果面沟的甜瓜自交系‘0426’为试验材料进行果面沟性状形态学和细胞学观察,并以两材料为亲本构建六世代群体,通过对群体表型统计完成甜瓜果面沟性状的遗传规律分析。同时,利用BSA和分子标记相结合的方法,完成甜瓜果面沟调控基因的精细定位;最后,通过基因功能注释和序列分析筛选候选基因。另外,本研究还选用7种甜瓜种质开展了甜瓜再生体系体系的初步研究,为后续进一步验证其功能奠定基础。本试验的研究结果如下:1. 以无果面沟的甜瓜自交系‘Y101’和有果面沟的甜瓜自交系材料‘0426’成熟期的果实为材料,通过形态学观察发现:亲本‘0426’的果实在瓜胎期(开花前1 d)果皮表面有条纹状的凹陷,为有果面沟表型;在瓜胎期至果实成熟的整个果实生长期都可以观察到果面沟性状,随着果实的膨大(授粉后15 d),果面沟逐渐加深,更利于观察。通过细胞学观察发现:甜瓜果面沟部位的果皮组织相对于甜瓜无果面沟部位的果皮组织细胞体积增大、细胞排列松散。2. 以‘Y101’和‘0426’为亲本,构建六世代群体对果面沟性状进行遗传分析,结果如下:P2(Y101)、F1和BC1P2无果面沟,P1(0426)有果面沟,BC1P1群体中有果面沟株数与和无果面沟株数比值符合1:1(c2=0.067,P=0.796),F2群体中无果面沟与有果面沟株数比值符合3:1(c2=0.617,P=0.432)。由此表明,甜瓜果面沟是由单隐基因控制,并将控制甜瓜果面沟的基因命名为Cmsf1(Cucumis melo sutured fruit1)。3. 为完成果面沟基因Cmsf1的定位,本研究合成并筛选249对SSR引物,并获得132对多态性标记。进一步利用BSA法构建果面沟基因池和无果面沟基因池,连锁分析发现位于11号染色体上的标记Chr11-15与果面沟性状连锁,经拆池验证后,以Chr11-15标记两翼多态性标记筛选重组单株,将Cmsf1基因初定位于标记Chr11-13和Chr11-16之间,物理距离为7.29 Mb。4. 为了精细定位Cmsf1基因,利用初定位标记Chr11-13和Chr11-16对扩大F2群体(2300株),共得到125株重组单株,通过利用亲本重测序开发38对高密度分子标记(28对CAPS引物、2对In Del标记、8对SSR引物)扫描重组单株,最终将Cmsf1基因定位于ZC11-85和ZC11-84之间,这两标记与Cmsf1基因之间的遗传距离为0.01和0.02 c M,定位区间为3.67 kb。5. 利用甜瓜参考基因组DHL92(V3.6.1)对定位区间进行分析发现:定位区间的序列中包括了一个1000 bp的Gap和一个ID为MELO3C001616.2.1的基因,其基因的功能注释为U-box domain-containing protein 7,该基因在两亲本的中序列上没有差异。利用FGENESH在定位区间内发现了一个ORF2,该ORF2在两亲本的中序列上没有差异。为了对Gap进行扩增,在Gap两侧合成4对引物,通过巢式PCR进行扩增得到672 bp和1430 bp的片段,经测序分析都不是Gap序列。推断基因组中的Gap序列的长度与实际长度存在差异。6. 通过对7个不同甜瓜种质的子叶节进行离体培养,统计各种质子叶节的不定芽诱导率发现,种质‘0426’和‘0544’子叶节的不定芽诱导率分别为78.3%和75%,明显高于其他种质,说明‘0426’和‘0544’可能适合作为再生体系的种质材料。
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