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目的：研究Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶SIRTI对转录因子NFAT(Nuclear factor of activated T cells)的作用及下游炎症基因的表达,探讨其对内皮细胞炎症作用及其机制。背景：SIRTI是酵母染色质沉默因子(Silent information regulator 2,Sir2)的哺乳动物同源体,属于Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶。Sir2家族的蛋白从细菌到人类都具有高度保守性,人Sirtuins是与Sir2具有同源性的一个家族,其中SIRTI是与Sir2同源性最高的一个成员,在许多生命过程,如细胞凋亡、细胞周期、DNA损伤修复、重组、长寿和基因沉默中都发挥了重要的作用。近年来的研究表明,SIRT1不仅可以去乙酰化组蛋白如组蛋白H3、H4等,而且与很多转录因子和转录辅因子相互作用,调节它们的转录活性。这些转录因子包括：p53、FOXO家族、NF-kB(P65)、MyoD等；转录辅因子包括：NcoR、p300、PGC-1a等。最近的研究认为SIRT1是血管内皮稳态的关键的调节者,它控制着血管生成,血管的收缩和内皮功能紊乱等,尤其可能具有抗炎的作用。但在血管内皮细胞中SIRT1确切的抗炎作用以及机制还不清楚。转录因子NFAT家族目前共发现有5个成员,分别是NFATcl, NFATc2, NFATc3, NFATc4和NFAT5,其中包括NFATc3前四个成员都依赖于钙信号通路调节。NFAT对细胞因子、生长因子等生理或病理信号发生应答,调节基因的转录,参与细胞的增殖、分化等过程。NFAT在血管系统中主要发挥功促进血管生成和炎症的功能。在内皮细胞中,NFAT下游炎症分子例如：COX-2, ICAM-1等在炎症中发挥了重要的作用。但在血管内皮细胞中NFAT参与炎症反应的调控机制还不清楚。材料和方法：本实验首先用Real-time PCR实验检测了PMA/Ionomycin(Io)在内皮细胞中是否诱导炎症基因的表达。为了证明NFATc3是否在内皮细胞中被PMA/Io诱导入核和激活,用免疫荧光的方法检测了PMA/Io处理内皮细胞后NFATc3核转位的改变。为了进一步证明NFAT是否介导了由PMA/Io诱导的炎症基因的表达,用NFAT的抑制剂CsA预处理内皮细胞,再用PMA/Io处理内皮细胞,Real-time PCR实验检测了炎症基因表达的改变。为了证明SIRT1对PMA/Io诱导的内皮细胞NFAT下游炎症基因表达的影响,用Real-time PCR和Western blotting (WB)的实验,在PMA/Io处理的内皮细胞中,过表达SIRTI或干扰SIRTI的表达,检测SIRTI对NFAT下游炎症分子表达的影响。为了进一步证明SIRT1对PMA/Io诱导的内皮细胞NFAT下游炎症基因的表达的影响,用SIRT1的激活剂resveratrol和抑制剂Sirtinol处理内皮细胞,Real-time PCR实验检测了炎症基因表达的改变。通过免疫共沉淀的方法,检测SIRT1与NFATc3之间的相互作用。为了证明SIRT1是否抑制了NFATc3的转录活性,在HEK293细胞中通过荧光素酶报告基因实验方法检测了SIRT1在基础水平和PMA/Io处理下对NFATc3的转录活性的影响。为了证明SIRT1是否通过去乙酰化NFATc3而抑制其转录活性,通过免疫共沉淀的方法,检测了SIRT1对NFATc3乙酰化水平的改变。为了进一步证明SIRT1对NFATc3的转录抑制是否影响了NFATc3与AP-1的相互作用,通过免疫共沉淀的方法,检测了SIRT1对NFATc3募集AP-1的能力的影响。结果：在内皮细胞中,PMA/Io诱导了炎症基因的表达,而且NFATc3介导PMA/Io诱导的炎症基因的表达；腺病毒介导的SIRT1高表达抑制了PMA/Io诱导的NFAT下游炎症基因的表达,并且SIRT1的激活剂resveratrol也能够抑制PMA/Io诱导的NFAT下游炎症基因的表达,并且SIRT1的抑制剂Sirtinol上调了NFAT下游炎症分子的表达。NFATc3可以和SIRT1相互作用,并且NFATc3 NHR和RHR结构域介导了与SIRT1之间的相互作用。进一步的研究发现SIRT1可以通过去乙酰化抑制NFATc3的转录活性。SIRT1不影响NFATc3募集AP-1的能力；最后研究还发现PMA/lo可以诱导内皮细胞内SIRT1的表达,这可能是一种细胞的负反馈保护机制。结论：我们首次发现NFAT可能是SIRT1的一个新的靶分子。SIRT1可以通过去乙酰化NFATc3,从而抑制其转录活性。在内皮细胞内,SIRT1可能通过抑制PMA/Io诱导的NFATc3活性,降低了下游炎症基因的表达及活性,从而抑制了炎症反应。因此,提高SIRT1的表达和活性可以作为一个调节炎症反应,保护机体的新手段。