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目的:许多微小RNA(micro RNAs,mi RNAs)在原发性肝癌(以下简称肝癌)中表达异常,提示mi RNAs有可能影响肝癌的发生及发展过程,但其作用机制尚不完全清楚。带有血小板凝血酶敏感蛋白样模体的解联蛋白金属蛋白酶9(a disintegrin and metallo-proteinase with thrombospondin motifs-9,ADAMTS9)是新近发现的肿瘤抑制因子,它在多种癌症的发生发展过程起重要作用。本实验主要通过实时荧光定量PCR(quantitative Real-time fluorescent quantitative PCR,q RT-PCR)的方法研究人肝癌细胞株SMMC-7721、Huh7、Hep G2中mi R-32的表达丰度,并通过双荧光素酶报告基因系统探讨mi R-32是否对ADAMTS9具有调控作用,从而评价mi R-32与ADAMTS9在肝癌细胞中的作用,这将为进一步研究肝癌的发病机制拓展新的思路,并在肝癌的早期诊治及生物治疗中拥有广泛的应用前景。材料和方法:1材料及试剂人肝癌细胞株SMMC-7721购自中国科学技术研究院上海细胞库,人肝癌细胞株Huh7、人肝癌细胞株Hep G2及人肾上皮细胞293T细胞株来自河北医科大学实验室;mi R-32过表达质粒和双荧光素酶报告基因3’UTR质粒由上海吉凯基因化学技术有限公司构建合成;mi R-32-5p inhibitor/NC由广州锐博生物有限公司合成。所用主要试剂有:DMEM高糖(Hyclone),RPMI 1640(Gibco);标准胎牛血清(四季青);胰蛋白酶(Trypsin-EDTA)(Solarbio);青链霉素混合液(100x)(双抗Solarbio);lipofectamine 2000(invitrogen);总RNA提取试剂(上海捷瑞公司);双荧光素酶报告基因检测试剂盒、逆转录试剂盒、q RT-PCR试剂盒(Promega);逆转录引物、实时荧光定量PCR引物(Invitrogen公司)。2细胞培养人肝癌细胞株SMMC-7721、人肝癌细胞株Huh7、人肝癌细胞株Hep G2及人肾上皮细胞293T细胞株分别以含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM高糖培养基、RPMI 1640培养基在37℃、5%CO2的细胞培养箱中常规培养,每2-3天使用0.25%胰蛋白酶进行消化、传代,取对数期细胞用于后续实验。3总RNA提取将细胞用PBS漂洗2次后加入4℃预冷的Trizol lml,冰上放置5min,加入氯仿200ul,剧烈晃动EP管约15s,冰上放置10min后4℃,8800rpm离心15min,将上清液转移到新的1.5ml RNase-free EP管中,加入0.5ml异丙醇,-20℃放置10min后4℃,8800rpm离心15min,用75%乙醇漂洗一次,再次离心后将乙醇晾干,用20ul灭菌DEPC水溶解沉淀的RNA过夜。用紫外分光光度计读取OD260/OD280,-80℃保存备用。4 q RT-PCR检测(1)RNA逆转录反应:检测mi R-32的表达时,向总RNA中加入mi R-32特异性茎环引物:5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACT GCAACTT-3’;检测ADAMTS9 m RNA表达时,加入逆转录试剂盒中的随机引物。按照逆转录试剂盒逆转录得到c DNA,设置反应条件为25℃5min,42℃60min,70℃15min,4℃+∞。(2)q RT-PCR:按照q RT-PCR试剂盒配制20u L反应体系,mi R-32上游引物为:5’-GTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’;下游引物为:5’-GCCGCTATTGCA CATTACTAAGTT-3’,ADAMT9上游引物为:5’-CATAATGAACAGGATGGGCCT-3’;下游引物为5’-TTGACCACATCCAGGGGTTG-3’,SYBR Green q RT-PCR扩增反应参数设置:95℃10min,95 15S℃,55℃(ADAMTS9 m RNA为57℃)30S,72℃30S,40个循环,每个样品设置3个平行管,每次实验重复3次;(3)数据分析相对表达水平用2-??Ct方法计算,mi R-32的表达选用U6基因为内参,ADAMTS9 m RNA的表达选用β-actin基因为内参。5细胞转染mi R-32过表达质粒组及mi R-32-5p inhibitor组瞬时转染人肝癌细胞株SMMC-7721。取处于对数生长期的细胞按1×106个/孔接种于6孔板,随后置于37℃、5%CO2的培养箱中常规培养至细胞密度达70%后,采用脂质体法瞬时转染肝癌细胞株SMMC-7721,mi R-32过表达质粒组按质粒(ug):脂质体(ul)=1∶2的比例转染;mi R-32-5p inhibitor组使mi R-32-5p inhibitor终浓度为150nm进行转染,转染后将细胞置于细胞培养箱中培养6 h后更换为含血清培养基,24h后收集细胞,提取RNA。6双荧光素酶报告基因检测取处于对数生长期的人肾上皮细胞293T细胞接种于24孔板,置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养20小时,细胞密度达70%,将细胞分为6组:共转染Pmi R-ADAMTS9-NC和mir-NC组、共转染Pmi R-ADAMTS9-NC和mi R-32组、共转染Pmi R-ADAMTS9-WT和mir-NC组、共转染Pmi R-ADAMTS9-WT和mi R-32组、共转染Pmi R-ADAMTS9-Mut和mi R-32-NC组、共转染Pmi R-ADAMTS9-Mut和mi R-32组,转染方法同前。转染24 h后吸尽细胞培养液,使用1x PBS清洗细胞2遍,每孔加入100u L稀释好的1x PLB,摇床常温条件下进行裂解。将白色不透光的96孔酶标板置于多功能酶标仪内,每孔加入之前的细胞裂解液20u L,做3个平行孔,实验重复3次,每孔分别加入100u L预先混好的萤火虫荧光素酶检测缓冲液,测定Firefly luciferase,检测完成后加入100u L海肾荧光素酶检测工作液,测定Renilla luciferase,用Firefly luciferase除以Renilla luciferase,所得值作为相对荧光素酶活性。7统计学处理实验数据以mean±SD表示,实时荧光定量PCR采用单因素方差分析,双荧光素酶报告基因检测采用t检验比较组间差异,实验所得数据资料采用SPSS17.0统计分析软件分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果:1 SMMC-7721,Huh7,Hep G人肝癌细胞株中mi R-32的表达使用紫外分光光度计检测所提取的RNA浓度及纯度,发现3株肝癌细胞总RNA的A260nm/A280nm比值在1.8~2.0之间,说明总RNA纯度较高,未见明显降解。q RT-PCR的熔解曲线显示,mi R-32及U6基因分别在80℃与82℃溶解曲线呈单峰,说明引物特异性良好,q RT-PCR结果可信。从扩增曲线中可以看出,扩增曲线均为S型曲线,各个样本的模板质量良好,可得到较合适有效的扩增。分析结果显示:3株肝癌细胞(SMMC-7721,Hep G2,Huh7)中mi R-32的表达无统计学差异(P>0.05),我们选用SMMC-7721进一步研究。2人肝癌细胞株SMMC-7721转染后mi R-32及ADAMTS9 m RNA表达情况使用紫外分光光度计检测所提取的RNA/质粒浓度及纯度,溶解曲线及扩增曲线分析方法同2.1。SMMC-7721转染后各组间相比较,mi R-32表达丰度分析结果显示:mi R-32质粒转染组中mi R-32表达上调(P<0.05),转染mi R-32-NC质粒组则无明显差异(P>0.05);mi R-32-5p inhibitor转染组中mi R-32表达下调(P<0.05),转染mi R-32-5p-NC质粒组则无明显差异(P>0.05)。SMMC-7721转染后各组间相比较,ADAMTS9 m RNA表达情况分析结果显示:转染mi R-32质粒组与转染mi R-32-NC质粒组ADAMTS9 m RNA相比较表达下调(P<0.05),与空白组相比则无明显变化(P>0.05);转染mi R-32-5p inhibitor组与转染mi R-32-5p inhibitor NC组ADAMTS9 m RNA相比较表达上调(P<0.05),与空白组相比较表达上调(P<0.05)。3双荧光素酶报告基因检测结果293T细胞转染24h后检测荧光素酶活性并将其标准化,结果显示:在转染Pmi R-ADAMTS9-wt组中,转染mi R-32同mi R-32-NC相比荧光素酶活性降低(P<0.05);当同时转染mi R-32时,Pmi R-ADAMTS9-wt组与Pmi R-ADAMTS9-mut组相比荧光素酶活性也同样出现了降低(P<0.05),结合以上结果说明mi R-32可与ADAMTS9 m RNA 3’-UTR结合,抑制荧光素酶活性,当未结合时,荧光素酶活性回复升高。结论:mi R-32通过与ADAMTS9 m RNA 3’UTR结合抑制ADAMTS9的转录,从而对抑癌基因ADAMTS9的表达进行调控。