论文部分内容阅读
背景:代谢相关脂肪性肝病（Metabolic associated fatty liver disease,MAFLD）,既往被称为非酒精性脂肪肝病,是世界上最常见的慢性肝病之一。九转黄精丸复方记载于《太平惠民和剂局方》,由黄精（Polygonati Rhizoma）和当归（Angelicae Sinensis Radix）两味药材配伍而成,用于补气养血。方中黄精具有补气养阴、健脾、润肺和益肾之功;当归具有补血活血、调经止痛和润肠通便之功,为补血、活血行瘀之要药;二者配伍有补益气血、健脾益肾和活血行瘀之功。研究表明,黄精主要由皂苷、多糖组成及黄酮组成,具有抗衰老、调节免疫力、调血脂等药理活性;当归主要由多糖和挥发油组成,具有增强造血功能、抗血栓、增强免疫力等药理活性。然而,九转黄精丸复方是否可以缓解MAFLD及相关作用机制仍不清楚。目的:采用体外和体内实验探究九转黄精丸复方缓解MAFLD的药效及相关作用机制。方法:细胞实验:将肝L-02细胞接种至6孔板中,分为正常组（正常培养液）、模型组（正常培养液）、非诺贝特组（150μmol/L）和九转黄精丸复方提取物组（10μg/m L、50μg/m L、100μg/m L）。肝L-02细胞先用5%医用脂肪处理24 h诱导脂肪变性L-02细胞模型,脂肪变性后的肝L-02细胞用含药培养液处理24h（正常组用正常培养液处理）。收集细胞,检测细胞中甘油三脂（TG）、总胆固醇（TC）、谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽还原酶（GSH）和ATP合酶活性。动物实验:60只SD雄性大鼠,随机分为正常对照组（生理盐水）、模型组（生理盐水）、白藜芦醇组（阳性对照,40 mg/kg）、九转黄精丸复方提取物低、中、高剂量组（2、4、8 g/kg）,连续灌胃给药12周,每天1次,除正常对照组外其余各组大鼠给予高脂饲料喂养12周诱发MAFLD大鼠模型。12周后,戊巴比妥钠麻醉处死大鼠,收集血清和脏器。检测血清TG、TC、AST、ALT、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平;测定脏器（肝、脾、肾）指数;油红O染色观察肝脏组织形态学变化,电镜扫描观察肝细胞线粒体结构;检测肝脏中TG、TC、HDL-C、LDL-C、AST和ALT水平,检测肝脏线粒体中丙二醛（MDA）、SOD、ATP合酶及呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ水平;qPCR检测大鼠肝脏中脂肪酸β氧化相关基因PGC-1α、ACADL、CPT1A、CPT1 B、PPARα和ACADM的表达量。采用UPLC/MS对九转黄精丸复方进入MAFLD大鼠肝线粒体的组分进行分析,探究九转黄精丸复方调节线粒体治疗MAFLD的活性物质。结果:细胞实验:采用5%医用脂肪乳处理L-02细胞24 h后成功诱导脂肪变性L-02细胞模型。给予九转黄精丸复方提取物后,细胞中TC、TG、AST和ALT水平显著降低（P<0.05,P<0.01,P<0.001）,SOD、GSH和ATP合酶活力显著升高（P<0.05,P<0.01,P<0.001）。动物实验:高脂饮食喂养12周后成功诱导大鼠MAFLD模型。给予九转黄精丸复方提取物后,大鼠肝指数降低,肝细胞内脂滴聚积减少,肝细胞线粒体超微结构有所改善,血清TG、ALT和AST显著降低（P<0.05,P<0.01,P<0.001）及HDL-C显著升高（P<0.001）,肝脏TC、TG、LDL-C和MDA显著降低（P<0.05,P<0.01,P<0.001）及SOD显著升高（P<0.001）,肝线粒体中MDA水平显著降低（P<0.01）及SOD、GSH、ATP合酶与complexⅡ活性显著升高（P<0.05,P<0.01,P<0.001）,肝脏中PGC-1α、ACADL、CPT-1A、CPT-1B和PPARα的m RNA水平增加（P<0.05,P<0.01）,而ACADM的mRNA水平显著降低（P<0.01,P<0.001）。从给予九转黄精丸复方提取物的MAFLD大鼠肝线粒体中指认出12种药源成分,分别为5-羟基麦芽酚、5-羟甲基糠醛、黄精素A、3,8-epoxy senkyunolide E-9-sulphate/Hydroxyl phthalide-o-sulphate、3-hydroxyl-3,8-dihydrogen senkyunolide E-9-sulphate、阿魏酸、6/7-hydroxyl-6,7-dihydrogen-Z/E-ligustilide-6/7-glutathione、天师酸、Senkyunolide F acetylcysteine、Senkyunolide D-O-sulphate、薯蓣皂苷元和Z/E-藁本内酯。结论:研究表明,九转黄精丸复方通过调节线粒体功能减轻高脂饮食诱导的MAFLD和多种危险因素,其机制可能与保护线粒体超微结构,减少氧化应激损伤,改善能量代谢和调节脂肪酸β氧化基因表达有关;同时,我们指认出九转黄精丸复方进入MAFLD大鼠肝线粒体的12个药源成分,它们可能是复方通过调节线粒体治疗MAFLD的主要活性物质。结果将为古方九转黄精丸的临床应用及深入开发提供重要科学依据。