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昆虫体内通常存在多种微生物,如细菌、病毒、真菌等,长期的进化过程中,昆虫与体内微生物间形成了多种相互关系,有的微生物种类能够影响昆虫的某些重要生命活动过程。棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)属于鳞翅目夜蛾科,是世界上许多经济作物的重要农业害虫之一,每年造成巨大的经济损失。通过RNA-seq的方法,本研究从棉铃虫体内发现了一种新的感染棉铃虫的病毒,命名为Helicoverpa armigera iflavirus(HaIV)。为了研究HaIV与寄主棉铃虫的相互作用关系,本文对HaIV的分子生物学特征、分子调控机制及生物学功能进行了研究,主要研究结果如下: 利用蔗糖密度梯度离心法,分离纯化得到HaIV病毒粒体,直径约30nm,通过基因克隆的方法,获得了HaIV的基因组序列,HaIV基因组全长10,017 bp,是单链正义RNA病毒,含有一条长的开放阅读框(ORF),编码一个由3021个氨基酸组成的多聚蛋白,多聚蛋白的预测分子量为344.16kDa,等电点(pI)为6.45。通过氨基酸序列比对,HaIV与Lymantriadispar iflavirus1(LdIV1)同源性最高,为61.0%,基于依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)序列进行聚类分析表明,HaIV与Iflavirus属的其他成员展现很高的同源性,因此,HaIV是隶属于小RNA病毒目(Picornavirales),传染性软腐病病毒科(Iflaviridae),传染性软腐病病毒属(Iflavirus)的一个新成员。 利用RNA-seq技术对HaIV侵染48h和72h两个时间点的棉铃虫幼虫进行转录组测序,总共获得了40,299个unigenes,HaIV侵染48h时,共有31584个基因的mRNA水平发生了变化,其中差异表达基因共有367个(占1.16%),上调基因138个,下调基因229个;侵染72h时,共有30457个基因的mRNA水平发生了变化,其中差异表达基因有484个(占1.59%),上调基因185个,下调基因299个,其中40个基因在两个时间点差异表达。GO功能分类结果表明,细胞组分中以细胞组分和细胞为主,分子功能中以催化活性和结合为主,生物过程中以细胞过程和代谢过程为主。差异基因表达分析表明,HaIV感染后与免疫反应相关的基因(C型凝集素、表皮蛋白)表达量显著下调;1个与产卵量相关的基因(卵黄原蛋白)表达量显著下调。 HaIV主要分布于棉铃虫成虫和幼虫的脂肪体中,能够经口感染进行水平传播和垂直传播。水平传播效率与病毒浓度有关,当病毒浓度为108 copies/μl时,棉铃虫病毒感染率达到100%,垂直传播效率相对较低,主要通过卵表面进行传播,雌雄虫都感染时,后代感染率为28.57%,且雌虫的垂直传播效率高于雄虫。HaIV感染棉铃虫后,在棉铃虫体内得到复制,随着时间的延长,HaIV拷贝数增加,并在幼虫期达到最高,其后趋于稳定。通过生物测定实验,发现HaIV能延长棉铃虫幼虫和蛹的生长发育时间,提高幼虫死亡率,降低化蛹率,但对蛹死亡率、羽化率和孵化率没有影响。通过棉铃虫田间种群HaIV感染率调查,发现HaIV的田间感染率极低,1188头个体中仅有24头感染,感染率为2.02%。 当棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)的浓度为1×107和1×108 OBs/ml时,感染HaIV(HaIV+)的棉铃虫幼虫存活率显著高于未感染的HaIV幼虫(HaIV-),当HaNPV浓度为1×109OBs/ml时,HaIV+幼虫存活率与HaIV-无显著差异,但HaIV+幼虫体内HaNPV拷贝数显著低于HaIV-,表明HaIV可能通过抑制HaNPV的复制,对棉铃虫幼虫起到一定的保护作用;随着时间的延长,棉铃虫幼虫平均发育得分增加,而随着Bt浓度的增加,棉铃虫幼虫平均发育得分降低,在不同Bt浓度下,HaIV+的幼虫平均发育级别均低于HaIV-,随着Bt浓度的增加,这一差异逐渐缩小,表明在高浓度Bt作用下,棉铃虫幼虫发育速率不受HaIV感染状态的影响;棉铃虫同时感染HaIV和HaDV2(棉铃虫浓核病毒)两种病毒时,幼虫和蛹生长发育时间显著延长,蛹死亡率和羽化率显著降低,幼虫死亡率和化蛹率与对照无差异。 综上所述,本研究在棉铃虫体内发现了一个新的RNA病毒HaIV,与Iflavirus属的成员具有较高的同源性,但具有一些新的特征,因此是Iflavirus属的一个新成员。HaIV感染棉铃虫后,诱导了与免疫相关的表皮蛋白基因显著下调。HaIV主要分布在棉铃虫成虫和幼虫的脂肪体中,能通过水平和垂直两种方式进行传播,但田间感染率很低。HaIV能延长棉铃虫生长发育时间,提高幼虫死亡率和对HaNPV的抗性。研究病毒与昆虫的相互关系是解析寄主昆虫适应性的重要基础,有助于为害虫防治提供新思路。