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目前,燃料乙醇作为新型清洁燃料,正无可争议地成为世界各国的研发重点。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)发酵产生乙醇的过程中,甘油的生成所消耗的碳源约占总碳源的4 %～10 %。减少甘油合成量可提高乙醇产率与碳源利用率。其主要策略是修饰或切除一步或多步代谢反应,或引入外源相关基因以改变碳流方向与碳流量,从而使反应向有利于生成更多乙醇而少生成甘油的方向进行。甘油是经由糖酵解途径(EMP)的中间物磷酸二轻丙酮引出的一条支路。磷酸二经丙酮经加氢还原为3-磷酸甘油后再脱去磷酸形成甘油。其中第1步反应由合成甘油的关键酶(GPD)所催化。GPD有2个同功酶,分别由基因GPD1和GPD2编码。以工业酒精酵母Saccharomyces cerevisiae Y为出发菌株,首先通过产孢率比较,选定McClary培养基为产孢培养基。通过生孢法获得6株单倍体,再与模式菌株W303-1A的杂交鉴定出此菌株的两个不同类型的单倍体α型和a型。以pUC19质粒为载体,构建含有GPD1同源基因的重组质粒pUC-GPD1::?Km,线性化后整合到S.cerevisiae-Y(a)的染色体,获得了突变GPD1基因的重组菌S.cerevisiae-Y(a,△gpd1)。将重组质粒pPIC-GPD2-bgl-hyg用限制性内切酶HindIII线性化后,电击转化进入感受态工业酿酒酵母S.cerevisiae-Y的a型单倍体和α型单倍体中,获得重组菌S.cerevisiae-Y(a,△gpd2)和S.cerevisiae-Y(α,△gpd2)。借鉴酵母双杂交技术原理,将S.cerevisiae-Y(a,△gpd1)和S.cerevisiae-Y(α),S.cerevisiae-Y(a,△gpd2)和S.cerevisiae-Y(α,△gpd2)分别进行群体杂交,通过产孢法和PCR的方法鉴定出分别全突变掉GPD1和GPD2基因的双倍体菌株S.cerevisiae-Y(△gpd1,△gpd1),S.cerevisiae-Y(△gpd2,△gpd2)。以葡萄糖为底物的发酵实验表明重组菌S.cerevisiae-Y(a,△gpd1),S.cerevisiae-Y(α,△gpd2)分别与S.cerevisiae-Y(a)和S.cerevisiae-Y(α)比较甘油产量则是下降了24.83 %和22.35 %,而酒精产量则都略有所提高。而重组菌S.cerevisiae-Y(△gpd1,△gpd1),S.cerevisiae-Y(△gpd2,△gpd2)与宿主菌S.cerevisiae-Y比较,它们的生长速率比较缓慢,葡萄糖的利用消耗速率也有所下降,同时它们的葡萄糖转甘油率分别较宿主菌下降了11.66 %和20.71 %,而葡萄糖转酒精率分别较宿主菌增加了5.90 %和13.20 %。同时考察了发酵的次要副产物丙酮酸和乙酸的产量,发现这两株重组菌的丙酮酸和乙酸量都有所减少。