卵巢癌(Ovariarycancer,OC)是常见的妇科恶性肿瘤之一。因起病隐匿,进展迅速,是死亡率最高的妇科恶性肿瘤。卵巢癌患者早期缺乏典型的临床症状,诊断困难,明确诊断时大多数患者已是晚期;尽管以手术为主的综合治疗的技术有很大提高,卵巢癌的5年生存率仍无显著改善。OC细胞播散并种植到腹腔,形成肿瘤并产生腹水是卵巢癌的常见临床表现,成为OC患者的主要致死原因。目前,对卵巢癌发生发展的分子机制并不明确,寻找OC发生发展过程中的关键调节通路和特异性分子,探讨其发病机制具有重要意义。肿瘤的发生与发展与多条信号通路相关。研究发现,参与胚胎发育和细胞分化的Wnt通路在肿瘤中被异常激活与多种已知的高发性癌变有关。根据Wnt蛋白转导信号方式的不同,Wnt通路可分为:经典的Wnt信号通路(β-catenin依赖性)和非经典的Wnt信号通路(β-catenin非依赖性)。其中,非经典Wnt信号通路通过激活下游信号通路(Wnt-Ca2+和Wnt-PCP)来参与调节细胞骨架形成过程和建立细胞极性。有实验表明,作为非经典Wnt信号通路中的经典基因一—WNT5A,在许多肿瘤中表达上调并促进其肿瘤细胞的转移和侵袭。值得注意的是,在不同肿瘤组织中,WNT5A会因为该信号通路中所激活的配体受体不同而发挥抑癌或促癌的双重作用。受体酪氨酸激酶 2 (Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2, ROR2)基因最早发现于成神经细胞瘤细胞系,位于9号染色体,属于受体酪氨酸激酶(Receptor tyrosine kinases, RTKS)家族中的一员。ROR2在胚胎发育过程中通常表达水平较高,在细胞运动和极性方面发挥重要作用。已有研究证实ROR2受体突变与Robinow综合征和Brachydactyly B1疾病有关,其均以骨骼发育不良为临床特点。此外,ROR2,作为WNT5A的受体或共受体,已经被证实参与调节WNT5A介导的非经典Wnt (β-catenin非依赖)信号通路,调节细胞生长、分化和肿瘤形成。目前研究发现,在结肠癌、肝癌,恶性血液病中,ROR2的表达受到抑制;另有一些实验表明ROR2在某些肿瘤细胞中表达上调,促进肿瘤生长、转移和侵袭,如黑色素瘤、骨肉瘤,肾细胞癌。研究表明:与WNT5A作用相似,ROR2在不同肿瘤组织中亦具有抑癌或促癌的双重作用。在卵巢癌的相关研究中,WNT5A作用复杂,既可作为癌基因促进卵巢癌细胞的转移侵袭,亦可作为抑癌基因通过促进细胞衰老抑制卵巢癌的发生发展。对于ROR2基因,现有研究发现其在卵巢癌中表达上调,但其下游信号通路的调节机制还尚不明确。本研究应用分子生物学相关技术探讨WNT5A/ROR2信号通路在卵巢癌发生发展中的作用及具体作用机制。第一部分ROR2在卵巢癌组织中的表达及与WNT5A相关性的研究研究目的:检测ROR2在卵巢组织中的表达,分析其与卵巢肿瘤患者临床病理特征的关系以及与WNT5A表达的相关性,初步探讨ROR2在卵巢肿瘤发生发展过程中的作用。研究方法:1.应用免疫组织化学技术检测ROR2基因在组织芯片(编号OV1005a和OV808)中的表达,组织包括3例正常卵巢,18例良性卵巢肿瘤,7例交界性卵巢肿瘤,45例原发卵巢恶性肿瘤及50例卵巢转移癌。并通过SPSS统计软件分析ROR2的表达与临床病理特征的相关性。2.应用免疫组织化学技术检测ROR2和WNT5A在36例原发性浆液性卵巢癌中的表达,Spearman检测分析其相关性。研究结果:1. ROR2在正常卵巢、良性卵巢肿瘤、卵巢恶性肿瘤和卵巢转移癌组织中的表达应用免疫组织化学法检测ROR2蛋白在正常卵巢(3例),良性卵巢肿瘤(18例),交界性卵巢肿瘤(7例),原发卵巢恶性肿瘤(45例)及卵巢转移癌(50例)组织中的表达。结果显示:在正常卵巢和良性卵巢肿瘤中主要在细胞浆中表达,在交界性卵巢肿瘤、卵巢恶性肿瘤及卵巢转移癌组织中,ROR2在细胞核及细胞质中均有表达。ROR2在正常卵巢和良性卵巢肿瘤、交界性卵巢肿瘤、卵巢恶性肿瘤及卵巢转移癌阳性表达率逐渐升高,依次为28. 57% (6/21)、 57. 14%(4/7)、60.00 % (27/45)和96. 00 % (48/50)。ROR2在卵巢恶性肿瘤及卵巢转移癌组织中的表达显著高于在正常卵巢和良性卵巢肿瘤中的表达。(卵巢恶性肿瘤:p = 0.0174,卵巢转移癌组织:p<0.0001);卵巢转移癌组织中的表达显著高于卵巢恶性肿瘤中的表达,p< 0.0001。2. ROR2在卵巢恶性肿瘤组织中的表达和OC临床病理学特征的相关性免疫组织化学法检测卵巢恶性肿瘤组织中ROR2的表达,结果显示:ROR2基因在卵巢恶性肿瘤细胞分化G1、G2和G3组的阳性表达率分别为57.69%(15/26)、86. 66% (39/45)和87. 50% (21/24);细胞分级G2/G3组的阳性表达显著高于G1组(1 vs 2,p=0.0058; 1vs 3,p = 0.0190)。ROR2基因在卵巢恶性肿瘤中Ⅰ/Ⅱ期的阳性率为62.85%(22/35),Ⅲ/Ⅵ期的阳性率为50%(5/10),经统计学分析差异无显著性(p>0.05)。ROR2基因的表达与患者年龄亦无统计学差异,p> 0.05。3. ROR2和WNT5A在浆液液性卵巢癌中的表达及其相关性应用免疫组织化学法检测ROR2和WNT5A在浆液性卵巢癌中的表达,结果显示:ROR2和WNT5A在细胞核及细胞质中均有表达,主要表达于细胞质中。在ROR2强阳性表达的16例组织中,WNT5A强阳性表达有12例,占75%;在ROR2中等阳性表达的12例组织中,WNT5A中等阳性表达有7例,占58.3%;在ROR2弱阳性表达的6例组织中,WNT5A弱阳性表达有5例,占83.3%;在ROR2阴性表达的2例组织中,WNT5A全部阴性表达,占100%。Spearman相关性分析结果显示:ROR2和WNT5A在卵巢癌组织中的表达具有相关性(r=0.440,pp<0.05)。研究结论:1. ROR2在卵巢恶性肿瘤及卵巢转移癌组织中高表达,尤其在卵巢转移癌组织中显著上调,表明ROR2可能参与了卵巢癌的侵袭转移过程,并作为癌基因参与卵巢癌的发生发展。2.在卵巢恶性肿瘤中ROR2的表达与组织分化程度相关,与病理分期及年龄无关。3. ROR2与WNT5A在浆液性卵巢癌中的表达具有相关性。第二部分靶向沉默ROR2对人卵巢癌细胞侵袭力影响的研究研究目的:探讨靶向沉默ROR2的表达对人卵巢癌细胞增殖、转移、侵袭能力的影响及机制。研究方法:1.应用Western blot技术检测ROR2蛋白在卵巢癌细胞系SKOV3、A2780、3AO和OVCAR3中的表达。2.应用外源性重组WNT5A蛋白预处理ROR2相对低表达的3AO和OVCAR3细胞;应用脂质体2000介导siRNA-ROR2 (siROR2)瞬时转染ROR2高表达卵巢癌细胞SKOV3和A2780;采用Western blot和免疫荧光染色来检测细胞内ROR2和WNT5A的表达变化。3.应用脂质体2000介导shRNA-ROR2质粒瞬时转染SKOV3、A2780细胞,通过Western blot技术和细胞免疫荧光法验证干扰效果;CCK实验检测ROR2表达水平的改变对卵巢癌细胞增殖能力的影响;细胞划痕和Transwell小室实验测定细胞转移和侵袭能力;Western blot检测EMT相关分子及WNT5A/ROR2信号通路下游因子的表达变化。研究结果:1.ROR2 在 SKOV3、A2780、3AO 和 OVCAR3 细胞中的表达应用Western blot检测ROR2在SKOV3、A2780、3AO和OVCAR3细胞中的表达,结果显示:ROR2在SKOV3和A2780细胞中的表达显著高于在3AO和OVCAR3细胞的表达(p<0.01)。但其在SKOV3和A2780细胞、3AO和OVCAR3细胞间的表达均无显著差异(p>0.05)。2. ROR2和WNT5A基因在卵巢癌细胞中的相关性通过重组WNT5A处理,对ROR2相对低表达的3AO和OVCAR3细胞行重组实验,Western blot检测ROR2的表达变化,结果显示:经过重组WNT5A处理的3AO和OVCAR3细胞后,ROR2的表达水平显著上升(3AO:p<0.01; OVCAR3 :p<0.05 )。通过转染siROR2对ROR2相对高表达的SKOV3和A2780细胞行ROR2基因敲除实验,结果显示:转染siROR2能显著降低ROR2基因在SKOV3和A2780细胞中的表达(p<0.01),然而,WNT5A的表达水平不受siROR2干扰的影响(p>0.05);细胞免疫荧光实验显示ROR2的荧光表达在转染组显著降低,而WNT5A的荧光表达无明显改变。3. ROR2基因在瞬时转染shROR2质粒的SKOV3和A2780细胞中的表达应用脂质体2000介导shRNA质粒干扰靶序列转染ROR2高表达的SKOV3和A2780细胞,Western blot检测ROR2在细胞内的表达,结果显示:瞬时转染的三条shROR2质粒均显著降低了 ROR2基因在SKOV3和A2780细胞中的表达(p<0.01)。细胞免疫荧光法检测结果显示:在瞬时转染shROR2质粒的SKOV3和A2780细胞中ROR2基因的荧光强度与阴性对照组相比显著降低。4.沉默ROR2基因对SKOV3和A2780细胞增殖能力的影响采用CCK8行细胞增殖实验,结果显示:通过瞬时转染shROR2质粒,沉默ROR2基因后的SKOV3和A2780细胞的增殖能力较阴性对照组下降(p<0.01);但SKOV3细胞系在转染后24h时间点的增殖能力无明显改变(p>0.05),在A2780细胞系中,转染后24h和48h时间点的增殖能力均无明显改变(pp>0.05)。5.沉默ROR2基因对SKOV3和A2780细胞转移和侵袭能力的影响应用划痕试验检测沉默ROR2基因对细胞迁移能力的影响,结果显示:瞬时转染shROR2沉默ROR2基因后,SKOV3细胞在24h和48h时间点的转移能力均较阴性对照组显著下降(p<0.01) , A2780细胞转移能力较阴性对照组亦显著下降(24h: p<0.05; 48h: p<0.01);通过 Transwell 小室探究 ROR2 对 SKOV3和A2780细胞侵袭能力的影响,结果显示:瞬时转染shROR2的SKOV3和A2780细胞的侵袭能力亦均显著下降(pp<0.01)。6.沉默ROR2基因对SKOV3和A2780细胞上皮间质转化的影响应用Western blot检测上皮间质转化(EMT)相关因子在细胞中的表达,结果显示:敲除ROR2的SKOV3和A2780细胞中上皮标记物E-cadherin和Keratin表达均上调,而间叶细胞标记物N-cadherin和Vimentin表达均下调(pp<0.05),关键转录因子Snail, Slug和ZEB1表达亦下调(p<0.05)。7.沉默ROR2基因对SKOV3和A2780细胞中非经典Wnt信号通路下游因子的影响应用Western blot检测非经典Wnt下游信号通路相关因子在细胞内的表达,结果显示:在敲除ROR2基因的SKOV3和A2780细胞中,非经典Wnt信号通路中的靶分子Rac1、RhoA、JNK、p-PKCδ和NF-κBp65蛋白表达水平下调(p<0.01)。研究结论:1. ROR2基因在SKOV3、A2780、3AO和OVCAR3细胞中均有表达,且在SKOV3、A2780细胞中的表达显著高于其在3AO和OVCAR3细胞中的表达。2.ROR2与WNT5A基因在卵巢癌细胞中的表达具有相关性,ROR2基因受WNT5A基因表达变化的影响,而WNT5A基因不受ROR2基因表达变化的影响。3. ROR2基因在卵巢癌中可能作为促癌基因参与细胞的增殖、转移、侵袭等恶性生物学行为,这可能主要通过激活非经典Wnt信号通路逆转上皮间质转化而发生。第三部分稳定转染shROR2细胞系及人卵巢癌裸鼠移植瘤模型的构建研究目的:构建稳定转染shROR2的SKOV3细胞系及其裸鼠移植瘤动物模型,进一步探讨ROR2的表达对SKOV3细胞增殖、转移、侵袭、粘附、细胞形态及肿瘤形成的影响。研究方法:1.应用G418筛选转染shROR2质粒和NC(阴性对照组)质粒后的SKOV3细胞,建立稳定沉默ROR2表达的SKOV3细胞系(SKOV3-shROR2)和其阴性对照组细胞系(SKOV3-NC)。荧光显微镜下观察细胞的荧光表达并通过Western blot检测ROR2在两组细胞中的表达变化,以判断稳筛效果。2.倒置显微镜观察拍摄细胞形态及消化状态的变化。3.应用CCK、克隆形成、细胞划痕、Transwell小室实验分别检测ROR2表达水平的改变对SKOV3细胞的增殖、转移和侵袭能力的影响。4.通过Western blot检测上皮间质转化相关分子及WNT5A/ROR2信号通路下游因子在裸鼠移植瘤中的表达变化。构建SKOV3-shROR2细胞的裸鼠移植瘤模型,观察ROR2表达水平的改变对肿瘤形成的影响。研究结果:1.成功构建稳定沉默表达ROR2基因的SKOV3细胞系经G418筛选,四周后获得稳定转染shROR2的SKOV3细胞系,命名为SKOV3-shROR2,同时构建其阴性对照组的SKOV3细胞系(SKOV3-NC)。荧光显微镜下观察发现:>90%的SKOV3细胞显示质粒载有的绿色荧光。同时Westernblot检测发现ROR2在SKOV3-shROR2细胞系中的表达较SKOV3-NC细胞系显著降低(p<0.01)。2.稳定沉默ROR2基因对SKOV3细胞形态及消化状态的影响在稳筛过程中,通过倒置显微镜对SKOV3-NC和SKOV3-shROR2细胞的细胞形态进行观察,SKOV3-shROR2细胞系失去了成纤维样细长的间质细胞形态,转而变成上皮样的圆钝的形态;在胰蛋白酶消化过程中观察发现,与SKOV3-NC细胞相比,SKOV3-shROR2细胞较易从培养皿壁上消化下来,且悬浮于培养液中的细胞粘连成较大的细胞团,表明其与细胞外基质的粘附性较弱,但细胞与细胞之间粘附地更为紧密。3.稳定沉默ROR2基因对SKOV3细胞增殖能力的影响通过CCK8行细胞增殖实验,结果显示:SKOV3-shROR2细胞系的增殖能力较阴性对照组细胞系显著下降(p<0.01),但在24h的时间点两组细胞增殖能力无明显改变(p>0.05)。通过克隆形成实验验证ROR2对SKOV3细胞群体依赖性和增殖能力的影响,结果显示:与SKOV3-NC相比,SKOV3-shROR2细胞在克隆数量显著减少(p<0.01)。4.稳定沉默ROR2基因对SKOV3细胞转移和侵袭能力的影响通过划痕试验检测SKOV3-NC和SKOV3-shROR2细胞系的迁移能力,结果显示:与阴性对照组细胞相比,SKOV3-shROR2细胞的转移能力显著下降(p<0.01);通过Transwell小室探究ROR2对SKOV3细胞系侵袭能力的影响,结果显示:SKOV3细胞在ROR2基因稳定沉默后,其侵袭能力显著下降(p<0.01)。5.稳定沉默ROR2基因对SKOV3细胞上皮间质转化的影响通过Western blot检测稳定沉默ROR2基因对SKOV3细胞系上皮间质转化相关因子的影响,结果显示:与瞬时转染结果一致,敲除ROR2的SKOV3细胞中上皮标记物E-cadherin和Keratin表达上调,间叶细胞标记物N-cadherin和Vimentin表达下调,关键转录因子Snail、Slug和ZEB1表达下调。细胞免疫荧光检测E-cadherin、N-cadherin、Snail和Slug在稳筛SKOV3细胞中的表达变化,结果发现E-cadherin的荧光表达在SKOV3-shROR2细胞中显著增强,而N-cadherin、Snail和Slug的荧光表达在SKOV3-shROR2细胞中显著减弱。6.稳定沉默ROR2基因对SKOV3细胞中非经典Wnt信号通路下游因子的影响通过Western blot检测细胞内非经典Wnt下游信号通路相关因子的表达,结果显示:与瞬时转染结果一致,敲除ROR2基因导致非经典Wnt信号通路中的靶分子Rac1、RhoA、JNK、p-PKCδ和NF-κBp65蛋白表达水平下调(p<0.01)。细胞免疫荧光检测Rac1和RhoA在稳筛SKOV3细胞系中的表达变化,结果发现Rac1和RhoA的荧光表达在SKOV3-shROR2细胞中显著减弱。7.稳定沉默ROR2基因的SKOV3细胞裸鼠移植瘤模型的构建成功构建SKOV3-shROR2卵巢癌移植瘤模型,观察发现注射SKOV3-shROR2细胞形成的肿瘤体积及重量显著小于阴性对照细胞组(p<0.01),表明敲除ROR2基因会抑制卵巢癌肿瘤的形成。通过Western blot检测瘤体组织中ROR2、VEGFA、MMP9和MMP13的表达,结果显示:SKOV3-shROR2移植瘤组的ROR2, VEGFA和MMP9蛋白的表达显著降低(p<0.01),而MMP13低表达且无变化(p>0.05)。研究结论:1.稳定沉默ROR2基因表达的SKOV3细胞形态发生了间质样向上皮样的改变,进一步表明ROR2基因可能参与卵巢癌的EMT发生过程。2.稳定沉默ROR2基因表达的SKOV3细胞与细胞外基质的粘附性较弱,而细胞与细胞之间粘附性较强,表明ROR2基因可能通过调节细胞的粘附作用参与卵巢癌的发生发展。3.稳定沉默ROR2基因不仅可有效抑制SKOV3细胞的增殖、克隆形成、转移、侵袭,而且能够抑制其在动物体内的成瘤率,这可能主要通过激活非经典Wnt下游信号通路逆转上皮间质转化而发生。