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肉类掺假一直是全球性挑战。近些年来，肉类掺假事件层出不穷，公众越来越关注食用肉类的质量和安全，并意识到肉类污染带来的危害。肉类掺假不仅对消费者的经济利益产生不利影响，还会对过敏体质者和宗教信仰者造成身心危害。传统检测方法灵敏度较低、操作复杂、需要较长的时间，对于肉类掺假问题不能进行快速检测。因此，开发一种可靠、有效的检测方法应用于肉制品掺假具有非常重要的意义。
本研究建立了针对牛肉中掺假马肉和猪肉的跨越式滚环等温扩增技术（Saltatory rolling circle amplification，SRCA）检测方法。SRCA方法只需两条引物就可完成等温扩增，且能够通过肉眼观察荧光，直接判断扩增结果。该方法可靠灵敏、特异性好、缩短了检测时间并且降低了成本。
本研究分别针对牛马猪的细胞色素b(cyt6)基因作为靶基因设计引物，并分别对牛肉、马肉和猪肉的SRCA反应体系及反应条件进行优化，最终分别确定了牛肉、马肉和猪肉的特异性引物和最优反应体系及反应条件。牛肉的最优SRCA反应条件及反应体系为:反应温度(63℃)，反应时间（60min），10mM dNTPs(5.0μL)，20mM Mg2+(1.5μL),10×ThermoPoI Reaction Buffer(2.0μL),10μM的正反向引物（各2.0μL），模板DNA（1.5μL阴性不添加），8000U/mL Bst DNA聚合酶（3.0μL），添加无菌去离子水将体系补足至20.0μL。马肉的最优SRCA反应条件及反应体系为:反应温度(64℃)，反应时间(65min)，10mM dNTPs(5.0μL)，20mM Mg2+(2.5μL),10×ThermoP01Reaction Buffer(2.0μL),10μM的正反向引物（各1.0μL），模板DNA（2.5μL阴性不添加），8000U/mL Bst DNA聚合酶（1.0μL），添加无菌去离子水将体系补足至20.0μL。猪肉的最优SRCA反应条件及反应体系为:反应温度(62℃)，反应时间(65min)，10mM dNTPs(3.0μL)，20mM Mg2+(1.0μL),10×ThermoPol Reaction Buffer(0.5μL),10μM的正反向引物（各1.5μL），模板DNA（0.5μL阴性不添加），8000U/mL Bst DNA聚合酶（2.0μL），添加无菌去离子水将体系补足至20.0μL。选取9种不同动物的新鲜肌肉组织来验证SRCA方法的特异性。结果表明，牛肉、马肉和猪肉对应的3对引物具有良好的特异性。
通过试剂盒法分别提取纯牛马猪肉及其二元混合物的模板DNA，进行SRCA反应，并与PCR方法进行比较。结果表明:SRCA凝胶电泳法检测牛马猪的灵敏度分别为7.1×101fg/μL、6.3×101fg/μL和6.5×101fg/μL。SRCA荧光可视法检测牛马猪的灵敏度分别为7.1×100fg/μL、6.3×100fg/μL和6.5×100fg/μL。PCR方法检测牛马猪的灵敏度分别为7.1×103fg/μL、6.3×103fg/μL和6.5×103fg/μL;SRCA凝胶电泳法和荧光可视法检测人工污染牛肉中掺假马肉的检出限为0.01％，PCR方法检出限为0.1％。SRCA凝胶电泳法和荧光可视法检测人工污染牛肉中掺假猪肉的检出限为0.01％，PCR方法检出限为0.1％。因此，SRCA凝胶电泳法的灵敏度是PCR方法的100倍，荧光可视法灵敏度是PCR方法的1000倍，SRCA荧光可视法的灵敏度是凝胶电泳法的10倍。SRCA荧光可视法及凝胶电泳法的检出限是PCR方法的10倍。
本研究采用行业标准方法(NY/T3309-2018)、PCR方法和SRCA方法对66份实际牛肉制品中的马肉和猪肉进行检测，得出SRCA方法检测牛肉制品中马肉的敏感性、特异性和符合率分别为100％、98.41％、98.48％,SRCA方法检测牛肉制品中猪肉的敏感性、特异性和符合率分别为100％、96.66％、98.48％。
综上所述，利用SRCA方法检测牛肉中的马肉和猪肉掺假切实可行，且该方法具有特异性强、灵敏度高、成本低、检测速度快等优点，可以应用于基层检测机构的检测。
本研究建立了针对牛肉中掺假马肉和猪肉的跨越式滚环等温扩增技术（Saltatory rolling circle amplification，SRCA）检测方法。SRCA方法只需两条引物就可完成等温扩增，且能够通过肉眼观察荧光，直接判断扩增结果。该方法可靠灵敏、特异性好、缩短了检测时间并且降低了成本。
本研究分别针对牛马猪的细胞色素b(cyt6)基因作为靶基因设计引物，并分别对牛肉、马肉和猪肉的SRCA反应体系及反应条件进行优化，最终分别确定了牛肉、马肉和猪肉的特异性引物和最优反应体系及反应条件。牛肉的最优SRCA反应条件及反应体系为:反应温度(63℃)，反应时间（60min），10mM dNTPs(5.0μL)，20mM Mg2+(1.5μL),10×ThermoPoI Reaction Buffer(2.0μL),10μM的正反向引物（各2.0μL），模板DNA（1.5μL阴性不添加），8000U/mL Bst DNA聚合酶（3.0μL），添加无菌去离子水将体系补足至20.0μL。马肉的最优SRCA反应条件及反应体系为:反应温度(64℃)，反应时间(65min)，10mM dNTPs(5.0μL)，20mM Mg2+(2.5μL),10×ThermoP01Reaction Buffer(2.0μL),10μM的正反向引物（各1.0μL），模板DNA（2.5μL阴性不添加），8000U/mL Bst DNA聚合酶（1.0μL），添加无菌去离子水将体系补足至20.0μL。猪肉的最优SRCA反应条件及反应体系为:反应温度(62℃)，反应时间(65min)，10mM dNTPs(3.0μL)，20mM Mg2+(1.0μL),10×ThermoPol Reaction Buffer(0.5μL),10μM的正反向引物（各1.5μL），模板DNA（0.5μL阴性不添加），8000U/mL Bst DNA聚合酶（2.0μL），添加无菌去离子水将体系补足至20.0μL。选取9种不同动物的新鲜肌肉组织来验证SRCA方法的特异性。结果表明，牛肉、马肉和猪肉对应的3对引物具有良好的特异性。
通过试剂盒法分别提取纯牛马猪肉及其二元混合物的模板DNA，进行SRCA反应，并与PCR方法进行比较。结果表明:SRCA凝胶电泳法检测牛马猪的灵敏度分别为7.1×101fg/μL、6.3×101fg/μL和6.5×101fg/μL。SRCA荧光可视法检测牛马猪的灵敏度分别为7.1×100fg/μL、6.3×100fg/μL和6.5×100fg/μL。PCR方法检测牛马猪的灵敏度分别为7.1×103fg/μL、6.3×103fg/μL和6.5×103fg/μL;SRCA凝胶电泳法和荧光可视法检测人工污染牛肉中掺假马肉的检出限为0.01％，PCR方法检出限为0.1％。SRCA凝胶电泳法和荧光可视法检测人工污染牛肉中掺假猪肉的检出限为0.01％，PCR方法检出限为0.1％。因此，SRCA凝胶电泳法的灵敏度是PCR方法的100倍，荧光可视法灵敏度是PCR方法的1000倍，SRCA荧光可视法的灵敏度是凝胶电泳法的10倍。SRCA荧光可视法及凝胶电泳法的检出限是PCR方法的10倍。
本研究采用行业标准方法(NY/T3309-2018)、PCR方法和SRCA方法对66份实际牛肉制品中的马肉和猪肉进行检测，得出SRCA方法检测牛肉制品中马肉的敏感性、特异性和符合率分别为100％、98.41％、98.48％,SRCA方法检测牛肉制品中猪肉的敏感性、特异性和符合率分别为100％、96.66％、98.48％。
综上所述，利用SRCA方法检测牛肉中的马肉和猪肉掺假切实可行，且该方法具有特异性强、灵敏度高、成本低、检测速度快等优点，可以应用于基层检测机构的检测。