【摘 要】
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家蚕p62蛋白(又名sequestosome-1,SilkDB:BGIBMGA002620-PA)具有多个功能结构域,在细胞自噬、凋亡等生命过程中起着十分重要的作用。家蚕p62的一个旁系同源蛋白(paralog)Ref(2)P比p62缺少一个PB1结构域,其他结构域完全相同。本论文主要研究了家蚕p62及Ref(2)P蛋白的核质穿梭特性及对BmNPV多角体蛋白亚细胞定位的影响,初步探讨了病毒与宿主之
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家蚕p62蛋白（又名sequestosome-1,SilkDB:BGIBMGA002620-PA）具有多个功能结构域,在细胞自噬、凋亡等生命过程中起着十分重要的作用。家蚕p62的一个旁系同源蛋白（paralog）Ref（2）P比p62缺少一个PB1结构域,其他结构域完全相同。本论文主要研究了家蚕p62及Ref（2）P蛋白的核质穿梭特性及对BmNPV多角体蛋白亚细胞定位的影响,初步探讨了病毒与宿主之间的“博弈”关系。主要结果如下:1.家蚕自噬受体蛋白p62及Ref（2）P核质穿梭特性分析⑴参考人类p62蛋白的核质穿梭特性,构建eGFP与p62、Ref（2）P的融合表达载体,转染BmN细胞后,激光共聚焦显微镜分析发现p62和Ref（2）P在细胞质中呈斑点状分布;加入出核转运抑制剂来普霉素B（Leptomycin B,LMB）,p62及Ref（2）P被转运到细胞核内。这些结果表明家蚕p62和Ref（2）P蛋白是CRM1依赖的核质穿梭蛋白。另外,p62（K8A/D59A）入核时间远快于野生型p62蛋白,表明PB1结构域对p62蛋白滞留在细胞质中起到重要作用。⑵以结构相对简单的Ref（2）P为研究对象,构建Ref（2）P的截短突变体和定点突变体,结合激光共聚焦显微镜观察和相关统计分析,对Ref（2）P的出核信号（nuclear export-signal,NES）和核定位信号（nuclear localization signal,NLS）进行了研究,确定NES位于aa482-612,分别为aa（NES1）和aa（NES2）;NLS序列个数较多且位于aa 1-350,已基本确定NLS个数。另外,aa（NES2）突变后,Ref（2）P蛋白呈弥散状,即Ref（2）P的NES2既是出核信号又与内涵体的形成有关。⑶Ref（2）P蛋白和polyhedrin共表达后在细胞质中共定位,且呈斑点状,表明Ref（2）P蛋白能将本来定位于细胞核中弥散状的多角体蛋白转运到细胞质并形成内涵体。家蚕Ref（2）P蛋白能发挥这种作用主要是因为其核质穿梭和形成内涵体的特性,且这两个特性必须同时存在。当aa（NES2）突变时没有此现象,且基本上都是可溶蛋白成分,没有内涵体的形成。⑷BmNPV T3感染后,家蚕Ref（2）P蛋白的亚细胞定位发生改变,由原来主要定位于细胞质,转变成主要定位于细胞核,且在细胞核内呈弥散状分布。Western bloting分析发现Ref（2）P的蛋白表达谱带多出一条带。该条带分子量比融合蛋白eGFP-Ref（2）P分子量小,推测是Ref（2）P被切割产生的。通过构建一系列截短突变体,确定切割位点位于aa 390-451,从而将Ref（2）P蛋白切割成两个多肽:一个多肽只含有NLS,另一个多肽只含有NES。2.家蚕p62及Ref（2）P蛋白翻译后修饰的初步研究初步认为家蚕p62及Ref（2）P蛋白存在泛素化修饰或者类泛素化修饰。对p62进行定点突变,发现当p62第XXX位的赖氨酸(Kxxx)突变后,p62形成的斑点变小,在每个细胞中的数量也增多,Western bloting分析所得的分子量亦明显减小;而Ref（2）P的Kxxx突变后,Ref（2）P蛋白呈弥散状分布于整个细胞,蛋白分子量明显减小。我们推测,Kxxx是家蚕p62和Ref（2）P的关键翻译后修饰位点,Kxxx的修饰可能对Ref（2）P的稳定性有重大影响。
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