山黧豆(Lathyrus sativus L.)是一种抗旱性极强、种植历史悠久的豆类作物。由于其氨基酸性质的毒素β-N-草酰-L-α,β-二氨基丙酸(β-N-oxalyl-L-α,β-diaminopropionic acid,β-ODAP)的存在和半胱氨酸(Cysteine, Cys)来源的有机硫营养水平很低,长期食用易使人畜中毒从而限制了在干旱半干旱地区的种植。为进一步了解β-ODAP的生物合成过程及环境因素影响β-ODAP含量的生理机制,并探索降低毒素提高硫营养(降毒升硫)的可能途径,本研究首先总结和分析了发育过程和外界因素影响β-ODAP含量的特点；其次,分析了叶片中β-ODAP含量与活性氧(Reactive oxygen species, ROS)种类O2·-和H2O2水平之间的关系；最后,在分离纯化P-ODAP前体物β-异噁唑-5-酮-丙氨酸[β-(isoxazoline-5-on-2-yl)-L-alanine, BIA]和化学合成异噁唑-5-酮(Isoxazoline-5-one)的基础上,重点研究了与BIA合成有关的半胱氨酸合成酶(Cysteine synthase, CSase)家族成员电泳图谱、活性分布规律,并分析了相关组织中BIA与谷胱甘肽(Glutathione, GSH)含量分布规律。所取得的主要结果如下：1、由正常发育过程和外界环境因素(如缺氮)影响β-ODAP积累的特点,提出山黧豆毒素β-ODAP含量升高可能与部分组织细胞的衰老、凋亡引起的氮素营养移动有关。氮素转移为β-ODAP的合成提供了必要的底物。2、通过对β-ODAP高效液相色谱分析和ROS定位染色与含量测定,发现山黧豆组织β-ODAP含量与ROS主要种类——O2·-和H2O2的水平高低有密切关系：低水平ROS有利于β-ODAP积累,而高水平ROS抑制β-ODAP积累。由此认为组织细胞低水平ROS环境是β-ODAP合成积累的必要条件。3、用Dower 50w阳离子交换层析对BIA进行了分离纯化并建立了有效的检测手段。结果发现,与传统分离材料豌豆相比,用山黧豆3天苗为材料可以防止许多与BIA性质相似物质的干扰,从而降低分离成本,提高纯化产量。4、通过丙炔酸乙酯与羟胺的反应对异噁唑-5-酮进行了化学合成。发现用氮气保护合成反应和氮气低温干燥技术,不但可以抑制氧化副反应、成倍提高合成产率,而且能得到高纯的目标产物。5、分析了山黧豆CSase家族同工酶非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)图谱；设计使用有效的浓度梯度(5%-15%)胶制备装置,不但显著改善了同工酶的电泳带型,而且提高了胶的分辨率,结合优化的显色与电泳条件使不同性质的同工酶依次得以分辨。最终发现山黧豆CSase家族至少有4种同工酶,按分子量由大到小命名为酶Ⅰ、酶Ⅱ、酶Ⅲ和酶Ⅳ。经分析确定酶Ⅰ和酶Ⅳ为本研究首次报导。6、分析了山黧豆半胱氨酸合成酶(CSase)和β-腈基丙氨酸合成酶(β-cyanoalanine synthase,CASase)活性分布,发现了酶Ⅰ-Ⅳ的活性分布规律。结合酶电泳图谱,可知酶Ⅰ为CASase,而酶Ⅱ-Ⅳ为CSase,其中酶Ⅱ和Ⅲ为山黧豆CSase家族的主要同工酶。酶Ⅰ主要在萌发时期的子叶、黄化苗和根中表达；酶Ⅱ主要在绿色组织中表达,而酶Ⅲ和Ⅳ在几乎所有的组织中均有表达。7、对比分析BIA含量和CASase酶活性分布规律,发现BIA的浓度高低与CASase酶活性高低呈正相关,而与CSase酶活性无相关性。另外发现异噁唑-5-酮与Cys合成BAI的效率是异噁唑-5-酮与OAS为底物合成时的近10倍。从而初步认为是CASase酶而不是CSase酶合成了BIA。8、进一步分析相关组织GSH的含量,发现GSH与BIA在组织中的含量分布呈负相关,尤其在有合成BIA能力的组织中。由此得出：山黧豆中BIA的合成、进而β-ODAP的积累需要特定的细胞生理环境,即至少满足低水平ROS、相关合成底物和高活性CASase酶。相关合成底物可能由核酸蛋白等降解产生,低水平ROS需要低水平的GSH,由此Cys合成GSH的反应减弱,使Cys更多的用于CASase合成BIA。由此导致相关组织中BIA与GSH含量呈负相关,进而β-ODAP与ROS水平呈负相关。根据以上结论,可以将山黧豆组织细胞分为两种类型：Ⅰ型细胞,即衰老凋亡早期的细胞；Ⅱ型细胞,即生长发育中的细胞。Ⅰ型细胞具备合成BIA及β-ODAP的生理环境,是组织中BIA和β-ODAP积累时的主要贡献者。Ⅱ型细胞中的β-ODAP主要来自Ⅰ型细胞,不一定具有合成BIA及β-ODAP的能力。