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背景:为了在感染过程中将遗传物质转移至靶细胞,包膜病毒利用其表面特殊的蛋白识别宿主细胞表面的受体分子以促进病毒包膜与靶细胞膜的融合。副粘病毒(paramyxovirus)属于有包膜的单股负链RNA病毒,包含多种能感染人和动物的重要病原体,例如人副流感病毒(human parainfluenza viruses,hPIVs)、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、副流感病毒 5 型(parainfluenza virus type 5,PIV5)等,这些病毒的吸附和膜融合过程是由病毒包膜表面两个不同的蛋白介导的:血凝素-神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase,HN)和融合蛋白(fusion protein,F)。人副流感病毒 3 型(human parainfluenza virus type3,hPIV3)是引起婴幼儿发生气管炎、支气管炎和肺炎的重要病原体。hPIV3HN是一种多功能糖蛋白,在病毒的入侵和感染过程中主要发挥识别靶细胞表面唾液酸受体,促进细胞融合和发挥神经氨酸酶的活性裂解唾液酸受体等功能。HN蛋白是II型病毒包膜糖蛋白,从N端到C端依次为胞质尾区(Cytoplamictail,CT)、跨膜区(TM)、胞外区域,其中胞外区域又由球状头部和螺旋状的颈部组成。有研究表明颈部区域可形成四卷曲螺旋束状(four-helixbundle,4HB)结构,并且颈部包含能与F蛋白发生特异性相互作用并激活F蛋白发生构象改变从而启动膜融合的氨基酸位点。近期关于hPIV3胞外域结构的研究表明,HN蛋白同源四聚化的头部呈现“头部下垂”的构象,其中两个头部(共价二聚体)与颈部4HB形成了对称的相互作用区。该区域包含了激活F蛋白关键的氨基酸残基位点,且下垂的头部在空间上遮盖了这些位点导致其无法与F蛋白发生相互作用。这种构象支持了一种模型,在此模型中,HN头部识别受体后会发生构象改变,从“头部下垂”(4-heads down)转化到“头部抬举”(4-heads up)状态释放了空间位阻,并促进了 HN颈部氨基酸与F蛋白发生特异性的相互作用。目前关于HN蛋白头部结构域的研究较为深入,但缺乏对其颈部结构域的研究报道,并且HN蛋白头颈部相互作用区在膜融合过程中所起的作用尚不清楚。本文将选取hPIV3 HN蛋白头颈部相互作用区15个氨基酸位点(头部7个,颈部8个),分别单点突变为丙氨酸,再分别进行受体识别活性、神经氨酸酶活性、促细胞融合活性及蛋白表达效率等多种功能的检测。目的:探讨hPIV3 HN蛋白头颈部相互作用区在促进细胞融合过程中的作用,探讨HN蛋白头颈部相互作用区影响膜融合的机制,试图定位该区域在膜融合过程中起关键作用的氨基酸位点。方法:通过比对hPIV3 HN与其高度同源的PIV5、NDV的HN序列,确定hPIV3 HN头颈部相互作用区的位置,并采用蛋白同源建模的方法在SWISS-MODLE软件上以NDVHN(PDB ID:3TIE)为模板得到hPIV3 HN“头部下垂”构象模型,以确定HN头颈部相互作用区的位置。1.采用PCR单点突变和菌内同源重组技术突变了该区域15个氨基酸位点(头部7个,颈部8个),突变成功后通过T7RNA聚合酶表达系统进行蛋白表达。2.分别采用吉姆萨染色法、指示基因法、R18探针荧光标记法定性定量分析各突变体HN蛋白对膜融合的不同时期促细胞融合活性的影响。3.红细胞吸附法检测各突变体HN蛋白的受体识别活性。4.神经氨酸酶检测试剂盒法测定各突变体HN蛋白的神经氨酸酶活性。5.采用间接免疫荧光和流式细胞术实验用于定性定量检测突变体HN蛋白的表达效率。6.统计学方法:实验数据为三次独立实验的重复结果,采用SPSS软件中的Student’s t检验分别将各突变体与野生型HN蛋白的实验数据进行两两比较分析,结果最终以x±SD形式表示,P<0.05被认为差别有统计学意义。结果:1.应用蛋白同源建模软件将hPIV3 HN蛋白“头部下垂”构象模型构建成功,通过氨基酸比对确定了 hPIV3 HN头颈部相互作用区的位置。并将该区域15个氨基酸定点突变,并分别命名为I112A、Q116A、M118A、D120A、R122A、K123A、S126A、E127A、R141A、1142A、D145A、G147A、I148A、L151A、N152A。2.对15个突变体蛋白采用三种不同类型的膜融合试验(吉姆萨染色法、指示基因法、R18探针荧光标记法)检测HN在膜融合过程中对促细胞融合活性的影响,三种实验得出的实验结果基本是吻合的。在与F蛋白共同表达的前提下,I112A、R122A、I148A和L151A这4个突变体的合胞体形成能力基本丧失,其内容物混合能力和半融合活性也大幅度降低;但是R141A、I142A和G147A这三个突变体与野生型HN相比,合胞体的数量不但没有减少,反而明显增多且合胞体的面积也有增大的趋势,同时内容物混合能力和半融合活性都明显增高。剩下的 8 个突变体(Q116A、M118A、D120A、K123A、S126A、E127A、D145A、N152A)虽然保留了合胞体的形成能力,然而合胞体形成的数量和面积都低于野生型,并且内容物混合能力和半融合活性也不同程度地降低。3.HN蛋白头颈相互作用区15个突变体蛋白中,只有L151A在细胞表面的蛋白表达效率降到野生型HN蛋白的38.09%,另外14个突变体蛋白的细胞表面的表达效率位于野生型的HN蛋白的86.31%～106.54%之间,与野生型HN相比差别无统计学意义(P>0.05)。4.受体识别活性分析结果表明:E127A、R141A、I142A、D145A、G147A这5个突变体蛋白的受体识别活性与野生型HN大体一致(位于野生型HN的88.3%～92.78%之间),经统计学分析差别无统计学意义。I48A和L151A受体识别活性降低幅度较大,分别为野生型HN的32.49%和24.61%。其它8个突变体蛋白受体识别活性仅为野生型HN蛋白的50%左右。5.各突变体蛋白(除R141A外)的神经氨酸酶活性与野生型HN相比都略有降低,R141位点突变为丙氨酸后使其神经氨酸酶活性增强,经统计学分析后差异均有统计学意义。结论:hPIV3HN蛋白头颈部相互作用区对膜融合功能有重要作用,该区域氨基酸突变后对促细胞融合活性、受体识别活性和神经氨酸酶活性都有不同程度的影响,L151A突变体还直接影响细胞表面蛋白质的表达水平,颈部1112、D120和R122氨基酸位点对膜融合活性的影响可能是由于突变后改变了 HN蛋白与同源F蛋白特异性相互作用而引起的。