中药在中国有着几千年的临床使用经验。随着民众对药品有效性和安全性认识的加深,中药质量受到越来越多的重视,中药质量控制也随着成为保障中药产业发展的重要因素之一和中药现代化研究的重要内容之一。由于中药的复杂性、多样性和物质基础研究的局限性,中药质量控制技术的发展成为中药质量控制的关键。在目前中药质量控制涉及到的众多分析方法中,能够适应新的理念和要求的方法无疑是色谱方法,从传统的薄层色谱、液相色谱、气相色谱到现在的毛细血管电泳及联用技术等,都在中药的复杂成分分析中展现了各自的优势,解决了许多问题。高效液相色谱以其多选的色谱柱、繁多的检测器、多变的流动相,适合于大部分化合物的分析测试,无疑是被广泛应用和最有前景的方法。微乳液相色谱(microemulsion liquid chromatography,MELC)法作为一项新技术,是以微乳为流动相的高效液相色谱法。微乳流动相通常是由水相、油相、表面活性剂和助表面活性剂组成,是一种透明或半透明的,低粘度的,各向同性且热力学稳定的水油混合系统,粒径小于100nm。MELC法与常规HPLC法相比,具有分离效率高和分离速度快的优势,可用于复杂样品的分离；血清、尿液经过简单的稀释后便可以直接进样分析,无需预处理；在梯度洗脱和低紫外波长(190nm)检测方面也有一定的优势。本文采用微乳液相色谱法,优化各个微乳流动相组成成分及比例,考察该法对中药成分中脂溶性和水溶性的分离分析情况,以及采用该法进行梯度洗脱和血浆直接进样测定的可行性,并与常规液相色谱法进行比较。最后对正相W/O型微乳色谱法进行了初步的探讨。1、考察MELC法对脂溶性成分的分析情况本实验选择大黄药材和中药制剂金益排石颗粒考察MELC法对脂溶性成分的分析情况。(1)建立大黄药材中5种蒽醌类衍生物的微乳液相色谱同时测定法,通过对影响分离度和保留时间的因素进行考察,得到最优微乳流动相体系,以2.5%SDS(w/v)-0.1%正辛烷(v/v)-8.0%正丁醇(v/v)-0.5%三乙胺(磷酸调PH至3.0)为流动相,色谱柱为Hypersil ODS2(4.6mm×250mm,5μm);流速1mL/min；柱温28℃；检测波长254nm,分离分析大黄药材中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚5种蒽醌类衍生物,进行方法学验证,并与常规HPLC法相比较。结果表明：A.大黄中5种蒽醌类衍生物达到基线分离,精密度在0.48%-1.29%之间,准确度高；回收率在97.53%～101.37%之间；具有较宽线性范围和良好的线性关系(r在0.9987～1.0000之间),满足定量要求。表明该法可用于大黄中5种蒽醌类衍生物的含量测定。B.在相同的仪器条件下,按文献报道的常规HPLC法,以甲醇-0.05%膦酸溶液(75：25)[28]为流动相时,5种成分全部分离,最后一组分(大黄素甲醚)平均保留时间为39.93min,但峰形较差；以甲醇-乙腈-0.01%磷酸溶液(3：5：2)[27]为流动相时,芦荟大黄素和大黄酸分离度差,大黄素甲醚塌峰,保留时间在15min以内；而以甲醇-0.1%磷酸溶液(85：15)[29]为流动相时,结果显示5个组分保留时间在17min以内,但样品中芦荟大黄素和杂质及大黄酸的分离度差,采用MELC法,虽然最后一组分的保留时间在36mmin以内,但5个组分的分离度和峰形都很满意。(2)建立金益排石颗粒中大黄酚含量的微乳液相色谱测定法。在分离分析大黄药材的基础上,进一步优化,缩短保留时间,以2.5%(w/v)SDS-0.1%(v/v)正辛烷-10%(v/v)正丁醇-0.5%三乙胺(v/v)(磷酸调pH至3.0)为微乳流动相,色谱柱为Hypersil ODS2(4.6mm×250mm,5μm);流速1mL·min-1；柱温28℃；检测波长254nm,分离分析中药制剂金益排石颗粒中大黄酚,进行方法学验证,并与常规HPLC法相比。结果表明：A.提高助表面活性剂正丁醇含量至10%,以缩短保留时间,成功测定中药制剂金益排石颗粒中大黄酚含量,在3.9ug·mL-1～39.0ug·mL-1范围内,与峰面积呈良好的线性关系(r=0.9998),平均加样回收率为99.66%,RSD为0.64%(n=6),说明该法可用于金益排石颗粒中大黄酚含量的测定。B.与文献上报道的常规液相色谱方法相比,分别以甲醇-0.1%磷酸溶液(85：15)和甲醇-0.1%磷酸溶液(65：35)[31]为流动相,测定金益排石颗粒中大黄酚的含量,实验结果显示,前者大黄酚峰形较差,后者没有分离出大黄酚,而采用MELC法,金益排石颗粒中大黄酚得到了很好的分离。(3)结论：MELC法同样可以分离成分复杂、性质相近的中药及中药制剂中的多种成分(脂溶性成分),与常规HPLC法相比,分离效果更好,可作为中药质量控制方法的新选择。2、考察MELC法对水溶性成分的分析情况本实验选择注射用双黄连冻干粉考察MELC去对水溶性成分的分析情况。建立了注射用双黄连冻干粉中绿原酸、连翘苷、黄芩苷的微乳液相色谱同时测定方法,并对其相关因素进行考察,最后得到最优微乳流动相体系2.0%(w/v)SDS-0.4%(v/v)正己烷-6.0%(v/v)乙醇-水(pH=3.0),采用Hypersil BDSC18柱(4.6mm×150mm,5μm),柱温为30℃,检测波长278nm和326nm。结果表明：1)被测组分绿原酸线性范围为192.0μg/mL～0.8μg/mL、连翘苷为104.0μg/mL～0.4μg/mL、黄芩苷为230.0μg/mL-0.9μg/mL,浓度与各自峰面积呈良好线性关系(r分别为0.9998；0.9999；0.9989)：对应的平均回收率和相对标准偏差RSD分别为：98.97%,0.20%；97.40%,1.09%；100.98%,1.11%。这表明微乳液相色谱法可用于注射用双黄连冻干粉中3个组分的含量测定。2)MELC法对水溶性成分也有良好的分离效果,可用于分离分析中药中极性大、水溶性好的多种组分(水溶性成分)。3、考察MELC法梯度洗脱对脂溶性和水溶性成分的分析情况本实验选择虎杖药材考察MELC法对脂溶性和水溶性成分的分析情况。应用MELC法,建立虎杖中虎杖苷、白藜芦醇、大黄素和大黄素甲醚含量的同时测定方法,并对其相关因素进行考察,得到最优微乳流动相2.5%SDS-0.1%正庚烷-6.0%异丙醇-0.5%TEA,磷酸调pH至3.0(A)和2.5%SDS-0.1%正辛烷-6.0%正戊醇-0.5%TEA,磷酸调pH至3.0(B)；梯度洗脱：0～13mmin,A-B为100：0；13～20min,A-B由100：0转变为0：100；20-38min,A-B为0：100,流速为0.8min/mL,检测波长299nm,柱温为25℃。结果表明：1)虎杖中虎杖苷、白藜芦醇、大黄素和大黄素甲醚的线性关系良好,线性范围分别为：9.13～91.3μg·mL-1(r=0.9998)、1.72～17.2μg·mL-1(r=0.9999)、8.12～81.2μg·mL-1(r=0.9998)和5.00～50.0μg·mL-1(r=0.9997),平均加样回收率和RSD值(n=6)分别为98.42%,0.87%；98.91%,0.59%；99.88%,1.06%和99.72%,1.26%。这表明MELC法梯度洗脱可作为虎杖中虎杖苷、白藜芦醇、大黄素和大黄素甲醚的同时测定。2)与等度洗脱对比,单独以A为流动相时,4组分保留时间在52mmin以内,4种组分完全分离；单独以B为流动相时,4组分保留时间在26min以内,但虎杖苷和白藜芦醇分离效果差。表明单独采用流动相A也能分离虎杖中4种组分,但保留时间比梯度洗脱长。3)与文献报道的常规HPLC法比较,采用乙腈-0.1%磷酸为流动相,两种梯度洗脱方法,一种4种组分完全分离,保留时间在39min以内,而采用MELC去4种组分保留时间在37min以内,效果相当；另一种4种组分也完全分离,但保留时间在53min以内,比MELC法保留时间长。表明MELC(?)与常规HPLC(?)相比,效果相当。4)在对微乳液相中表而活性剂、油相、助表面活性剂种类及其浓度和洗脱方式进行筛选时,发现极性大、水溶性好组分的保留时间基本上不受其影响,而对极性小、水溶性差组分保留时间影响较大,比如改变助表面活性剂类型,分别以正丁醇、正丙醇、异丙醇及正戊醇为助表面活性剂,虎杖苷及白藜芦醇的保留时间基本上不变,而对大黄素及大黄素甲醚的保留时间影响很大,表明：O/W型微乳液相色谱法对脂溶性成分有更好的选择性。5)结论：本实验首次采用了梯度洗脱研究微乳液相色谱法在中药中脂溶性和水溶性成分分析中的应用,结果表明微乳—微乳流动相梯度洗脱,基线较平稳,可用于中药材中极性差别较大成分的分离测定。4、考察MELC法血浆直接进样情况如何简化生物样品的前处理过程一直是分析工作研究的热点。本实验选择紫杉醇作为研究MELC法血浆直接进样情况的试验药物,建立了人血浆中紫杉醇浓度的微乳液相色谱直接进样测定法,优化微乳组成体系,得到最佳的微乳体系组成为：2.0%(w/v)SDS-0.4%(v/v)正辛烷-10.0%(v/v)正丁醇-89.6%水(磷酸调pH至4.0)。选择Hypersil ODS2色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),柱温25℃,流速1mL·min-1,检测波长227nm,血浆与微乳流动相以1：1的比例稀释,离心,经微孔滤膜滤过后直接进样测定。结果表明：1)紫杉醇在0.064μg·mL-1～1.96μg·mL-1范围内与峰面积成良好线性关系(r=0.9993),日内、日间精密度RSD均小于5%(n=5),最低定量限为0.064μg·mL-1。表明采用MELC法血浆直接进样分析生物样品是可行的。2)以微乳流动相作为溶剂,是微乳的一个独特性质,可以溶解蛋白,使生物样品不用经过繁琐的前处理而直接进样,从而减少可能的操作误差。3)MELC法血浆直接进样,对色谱柱的影响较大,测定期间,需用水冲洗色谱柱2-3小时,以保证实验的重现性及延长色谱柱的寿命。5、考察油包水(W/O)型MELC法对水溶性成分的分析情况前面的研究都以水包油(O/W)型微乳作为流动相考察MELC(?),本实验尝试选择W/O型微乳流动相考察其对水溶性成分的分析情况,建立了测定甘草中甘草酸含量的油包水型微乳液相色谱法,采用正相色谱柱,以W/O型微乳为流动相,优化微乳组成体系,考察其对甘草药材中甘草酸分离效果的影响,最终得到最优的微乳流动相为8.33%(w/v)SDS-16.6%(v/v)戊醇-78.4%(v/v)己烷-5%(v/v)(70mmM)醋酸钠(1mol/L HCl溶液调pH值至7.5)。选择Spherisorb SiO2色潜柱(4mm×200mm,5μm),柱温25℃,流速为0.8mL·min-1,检测波长为250nm。结果表明：1)甘草酸在18.3μg·mL-1～91.5μg·mL-1范围内与峰面积呈良好线性关系(r=0.9998),平均加样回收率(n=6)和RSD值分别为99.58%、0.96%。表明该法可用于分离分析甘草中甘草酸。2)采用同一仪器及色谱条件,尝试分离绿原酸、连翘苷及黄芩苷对照品,虎杖苷及白藜芦醇对照品,苦参碱对照品,川芎嗪对照品,结果显示洗脱能力很强,色谱条件可能需要进一步优化。3)W/O型MELC(?)的分析特点有待进一步研究。综上所述：1.MELC(?)可以用于中药及制剂中复杂成分的分离分析,对脂溶性、水溶性成分均有良好的分离效果,O/W型微乳流动相对脂溶性成分有更好的分离可操作性。方法学验证结果表明可满足定量要求。2.MELC法可同时分离脂溶性成分与水溶性成分,O/W型微乳流动相对脂溶性成分有更好的选择性。3. MELC法可采用梯度洗脱以满足不同成分的分离分析,梯度洗脱时基线较稳定。4. MELC法在分析血浆等生物样品时,样品可直接进样测定,简化了样品的前处理过程,减少了可能的操作误差,方法满足定量要求。5.MELC法与常规HPLC相比,有相同的甚至更好的分离效果与分析效率；成本上,O/W型微乳流动相大大减少了有机溶剂的使用,降低了有机污染和分析成本。6.正相微乳色谱(W/O型微乳流动相)可以用于中药的成分分析,分析特点有待进一步研究。