【摘 要】
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目的:为了探讨dhx15基因在肠道发育过程中的作用,利用斑马鱼作为模式生物,研究dhx15基因在斑马鱼早期肠道发育过程中的作用及机制。方法:本课题组前期已通过Talen基因敲除技术构建了斑马鱼dhx15基因敲除杂合突变体dhx15+/-,经交配获得的dhx15+/+（野生型）、dhx15-/-（纯合突变体）斑马鱼胚胎作为研究对象。应用Tol2转座酶系统编辑技术,将人源DHX15野生型CDS全长插入
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目的:为了探讨dhx15基因在肠道发育过程中的作用,利用斑马鱼作为模式生物,研究dhx15基因在斑马鱼早期肠道发育过程中的作用及机制。方法:本课题组前期已通过Talen基因敲除技术构建了斑马鱼dhx15基因敲除杂合突变体dhx15+/-,经交配获得的dhx15+/+（野生型）、dhx15-/-（纯合突变体）斑马鱼胚胎作为研究对象。应用Tol2转座酶系统编辑技术,将人源DHX15野生型CDS全长插入质粒Tol2-hsp70-2A-mecherry构建条件性表达DHX15的转基因斑马鱼Tg（hsp70:DHX15-2A-mcherry）。本研究在前期工作的基础上进行了以下实验:1、显微镜下直接观察比较dhx15+/+与dhx15-/-斑马鱼胚胎肠道形态,并通过组织切片（HE染色）比较受精后5.5天（5.5dpf）时期dhx15+/+与dhx15-/-斑马鱼胚胎肠道的解剖结构。2、应用WISH（whole mount insitu hydrization整胚原位杂交）检测dhx15敲除后对斑马鱼胚胎肠道发育的影响（fabp2、apoa4b、aqp3、fabp6标记基因在5.5dpf的表达）。3、在dhx15-/-基础上条件性过表达人源的DHX15基因,获得dhx15-/-;Tg（hsp70:DHX15-2A-mcherry）斑马鱼胚胎,在受精后24小时（24hpf）时42℃热激2h后利用WISH检测,比较在5.5dpf时肠道标记基因（fabp2、apoa4b、aqp3、fabp6）的表达差异并明确人源DHX15基因是否能回救dhx15-/-斑马鱼胚胎消化系统表型。4、应用免疫荧光技术比较dhx15+/+与dhx15-/-斑马鱼胚胎肠道细胞增殖（有丝分裂期的标志蛋白PH3）及凋亡（Caspase-3）情况。5、应用高通量的转录组测序（RNA-seq）技术检测dhx15+/+与dhx15-/-斑马鱼胚胎样本以寻找差异表达基因（DEGs）。利用Bgee数据库（https://bgee.org）筛选出斑马鱼肠道特异性表达基因群,并利用诺禾公司提供的novomagic平台进行分析并筛选肠道特异性DEGs。6、通过GO（Gene Ontology）富集分析及KEGG通路分析,从转录组测序结果中筛选dhx15-/-斑马鱼胚胎DEGs富集明显的通路。7、应用q RT-PCR验证dhx15+/+与dhx15-/-斑马鱼胚胎中信号通路相关分子的表达变化,进一步确认dhx15所影响的信号通路相关基因的表达情况。结果:1、dhx15-/-斑马鱼胚胎出现早期肠道结构异常,肠道轮廓模糊,前肠扩张不全以及肠上皮皱襞消失,肠壁变薄。2、WISH结果显示dhx15-/-斑马鱼胚胎肠道上皮细胞特异性标记基因表达明显减少甚至消失。3、条件性过表达人源DHX15基因回复dhx15-/-斑马鱼胚胎肠道发育缺陷,可回复其肠道上皮细胞特异性标记基因表达缺陷。4、dhx15-/-斑马鱼胚胎可能引起肠道细胞增殖减少,凋亡增加。5、dhx15-/-组与对照相比存在差异表达基因（DEGs）8986个,其中实验组上调基因4535个,下调基因4451个。dhx15-/-组与对照相比存在肠道特异性DEGs有7561个,其中上调基因3179个,下调基因4382个。6、将RNA-seq结果中DEGs进行GO（Gene Ontology）富集分析,发现与对照相比,dhx15-/-主要影响发育过程、细胞凋亡等生物学进程;DEGs富集于Wnt信号通路等KEGG通路条目中。7、q RT-PCR结果证实dhx15可影响Wnt信号通路。结论:1、dhx15基因为斑马鱼肠道发育的必需基因。2、dhx15-/-斑马鱼胚胎出现早期肠道结构异常,肠道轮廓模糊,前肠扩张不全以及肠上皮皱襞消失,肠壁变薄。3、dhx15可能主要通过Wnt信号通路调控斑马鱼的早期肠道发育。
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