Zwittermicin A(ZmA)是一种聚酮-非核糖体肽杂合的物质,它由一些芽胞杆菌所产生,包括蜡状芽胞杆菌菌株UW85和苏云金芽胞杆菌菌株YBT-1520。ZmA一方面具有抗生素广谱的抑菌活性,一方面对苏云金芽胞杆菌的晶体蛋白有杀虫增效活性。其特殊的分子结构和多样的生物活性,使得我们有兴趣对其开展合成基因簇的鉴定及调控机制的研究。国外的研究团队通过对菌株UW85中与ZmA合成相关的非核糖体肽酶(nonribosomal peptide synthetase, NRPS)和聚酮合酶(polyketide synthase, PKS)功能域的分析,推测了ZmA的合成途径,但是并没有给出直接的实验证据,也没有表明基因簇的完整性。在本研究中,我们期望通过异源表达的方式来鉴定ZmA完整的合成基因簇。为此,我们构建了菌株YBT-1520的全基因组细菌人工染色体(BAC)文库。文库包含1200个克隆子,平均插入片段大小为45Kb,文库约覆盖总基因组10倍。以已知与ZmA合成相关的基因设计引物为探针,通过聚合酶链反应(PCR)到文库中经行筛选,得到了9个阳性克隆。将这9个阳性克隆末端测序,结合其限制性酶切物理图谱和菌株YBT-1520基因组测序,构建了覆盖ZmA合成基因簇的重叠联合群,该重叠联合群共覆盖了103Kb区域。通过本研究所构建的在芽胞杆菌中相容的、可克隆大片段的穿梭载体pEMB0557、pEMB0603和pEMB0606,将这9个阳性克隆的插入片段组合式的导入不产ZmA的苏云金芽胞杆菌菌株BMB171中,检测ZmA的表达。有2个BAC克隆子的插入片段(总共覆盖约60Kb的DNA区域)共同导入菌株BMB171后,可以产生ZmA,表明该60Kb对于ZmA的合成是充分的。在这60Kb区域下游,有一个之前未经发现的基因簇,含有三个开放读码框,命名为zmaWXY,将包含该基因簇和60Kb基因簇(共约70Kb)的2个BAC克隆子组合在BMB171中表达发现,ZmA的产量有所增加。实验证实,ZmaWXY为ZmA抗性转运蛋白,其可以阻止ZmA分子进入胞内,是不同于乙酰化酶ZmaR(早先报道的ZmA抗性基因表达蛋白)的另一种抗性机制；同时,增加抗性基因zmaWXY或zmaR的拷贝数,可以提高ZmA的产量。对于抗生素的产生菌,为了防止其被自身所产生的抗生素所抑制,一定存在相应的抗性机制。早前就有研究报道指出,对于ZmA产生菌,将抗性基因zmaR突变后,其仍然可以产生ZmA,但对高浓度的ZmA变得敏感,说明一定存在着其他抗性机制,但一直未知。结合我们在本研究中的发现,我们提出了完整的ZmA产生菌对ZmA抗性免疫的模式：ZmaWXY首先阻挡胞外一定浓度的ZmA进入胞内,当胞外ZmA的浓度超过ZmaWXY所能发挥的功能阈值时,ZmA分子仍然可以进入胞内,此时就由胞内的ZmaR发挥乙酰化功能,使ZmA分子失去抗生素活性,从而保证产生菌的安全。此外,我们在60Kb基因簇内部还发现了一个之前未发现的基因orf123,对其进行基因缺失突变后发现ZmA的产量明显提高,推测其为潜在的ZmA合成的负调控基因。在这两个基因簇的两端(70Kb),存在推测的转座酶基因,暗示这两个基因簇是可移动的区域并且涵盖ZmA完整的合成基因簇。通过本研究,我们利用异源表达手段确认了ZmA完整的合成基因簇,指出完整的基因簇由合成、抗性免疫和调控三个部分组成；发现并证实了与zmaR互补的、新的ZmA抗性基因zmaWXY,并提出了ZmA产生菌对ZmA完整的抗性免疫模式；揭示了潜在的ZmA合成的负调控基因orf123。本研究还建立了通过异源表达方式,从芽胞杆菌、甚至其他细菌中直接克隆、鉴定大片段功能基因簇的平台。